你是伐木的還是劈柴的？幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，生物學(xué)家一直在思考這個(gè)基本的認(rèn)識(shí)論二分法問題：他們是應(yīng)該對(duì)廣闊的生命領(lǐng)域進(jìn)行全面的研究，還是走還原主義的道路，將其分解成最基本的組成部分？
分子生物學(xué)家們長(zhǎng)期以來(lái)以還原主義者自居，但是卻始終有一個(gè)令人沮喪的制約條件。當(dāng)他們以驚人的速度和精準(zhǔn)度對(duì)DNA和RNA進(jìn)行測(cè)序時(shí)，他們的數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的是整個(gè)細(xì)胞群體的混合信息，而非單個(gè)的基因組。無(wú)論是一個(gè)組織切片，一個(gè)腫瘤活檢樣品，還是一個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)樣品中所得到的測(cè)序數(shù)據(jù)展現(xiàn)的都是樣品中所有細(xì)胞基因組的平均信息，雖然研究人員知道每個(gè)樣品中細(xì)胞與細(xì)胞之間都可能有著驚人的多樣性。
在過去的幾年里，研究人員和設(shè)備商終于開始打破這個(gè)技術(shù)瓶頸，開發(fā)出一系列新的工具和技術(shù)用于單細(xì)胞測(cè)序。單細(xì)胞RNA測(cè)序現(xiàn)在能夠完整地繪制單個(gè)樣品中的轉(zhuǎn)錄活性譜圖，而單細(xì)胞DNA測(cè)序數(shù)據(jù)可以揭示那些從前看起來(lái)一樣的細(xì)胞之間基因組中的微小差異。新的結(jié)果是令人振奮的，但是有些技術(shù)，尤其是DNA測(cè)序，也對(duì)新手隱藏了一些陷阱。
讀通轉(zhuǎn)錄組
在兩種技術(shù)中，單細(xì)胞RNA測(cè)序得到了更多的支持。有些公司在出售相關(guān)的試劑盒設(shè)備，用來(lái)從單細(xì)胞中分離RNA，同時(shí)可以獨(dú)立保存數(shù)以千計(jì)的樣品。還有些公司將這些技術(shù)作為一種服務(wù)來(lái)提供，他們拿走客戶裝有細(xì)胞的樣品管，再送回完整的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。計(jì)劃進(jìn)行大量單細(xì)胞RNA分析的研究人員甚至可以購(gòu)買完整的系統(tǒng)。
“任何人都可以購(gòu)買我們的系統(tǒng)，我們就是打算把它做成一個(gè)高度分布式，易于使用的平臺(tái)。”位于加州普萊森頓的10X Genomics公司的首席科學(xué)官和共同創(chuàng)始人Ben Hindson解釋說。10x系統(tǒng)使用微流控芯片將細(xì)胞樣本分割成數(shù)十萬(wàn)個(gè)微小液滴。然后這些液滴與凝膠珠混合，每個(gè)凝膠珠都帶有獨(dú)特的寡核苷酸“條形碼”。10x的專有條形碼合成和混合系統(tǒng)確保幾乎每個(gè)細(xì)胞都有一個(gè)對(duì)應(yīng)的條形碼珠。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)的RNA測(cè)序技術(shù)就可以產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)個(gè)短序列，包括細(xì)胞RNA和條形碼。通過將RNA序列與條形碼連接，系統(tǒng)的開源軟件可以為每個(gè)細(xì)胞重建RNA序列池。
整理這么多數(shù)據(jù)顯然需要復(fù)雜的計(jì)算，但Hindson表示，他們公司非常重視保持系統(tǒng)的用戶友好性。“我們的目標(biāo)是把萬(wàn)能鑰匙型解決方案交給那些生物信息學(xué)功底不太深厚的用戶，”他還補(bǔ)充道，“這使得系統(tǒng)的受眾更加廣泛”。10x的軟件不僅包括解碼單細(xì)胞數(shù)據(jù)所需的基本功能，還包括一套用于分析和可視化的工具。因?yàn)?0x軟件是開源的，經(jīng)驗(yàn)豐富的用戶可以對(duì)其進(jìn)行修改，甚至將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出到自己的程序中。
然而，在購(gòu)買單細(xì)胞RNA系統(tǒng)或?qū)颖舅徒o外包服務(wù)公司之前，研究人員應(yīng)該仔細(xì)考慮他們的需求。他們應(yīng)該問問自己：“你在分析什么類型的樣品，你需要達(dá)到什么樣的靈敏度，從這些細(xì)胞中你想要獲得什么樣的信息？”Hindson解釋說。專精于這些技術(shù)的公司樂于和潛在客戶討論這些問題。Hindson補(bǔ)充道，那些看起來(lái)簡(jiǎn)單的問題，比如測(cè)序之前細(xì)胞如何分離和保存，都可能對(duì)數(shù)據(jù)的質(zhì)量造成巨大的影響。
選取任何一個(gè)細(xì)胞
小心細(xì)致的樣品處理是許多單細(xì)胞分離策略的基本要求，這一類型的方法近年來(lái)呈指數(shù)增長(zhǎng)。分析DNA比RNA更需要選擇好的單細(xì)胞分離方法，這一點(diǎn)尤為重要。
“有很多選項(xiàng)，但是每一個(gè)選項(xiàng)都有它的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。對(duì)于研究人員來(lái)說，根據(jù)他們的具體應(yīng)用來(lái)選擇合適的分離方法，這很重要。”德國(guó)希爾登的Qiagen公司的生命科學(xué)部高級(jí)市場(chǎng)經(jīng)理Mary Langsdorff說。
對(duì)于那些知道目標(biāo)細(xì)胞是什么樣子的研究人員來(lái)說，最好是手工挑選。為了盡量溫和地做到這一點(diǎn)，Qiagen公司的QIAscout細(xì)胞分離系統(tǒng)將細(xì)胞分散在一個(gè)有磁性的膜片微陣列上。從而，研究人員只需使用一臺(tái)普通的倒置顯微鏡就可以將所需的細(xì)胞取出，并將其轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的樣品管或微滴孔中。
一旦完成細(xì)胞分離，下一步就是選擇一種分析策略。對(duì)于DNA測(cè)序，首先需要擴(kuò)增每個(gè)細(xì)胞的基因組，以便構(gòu)建測(cè)序庫(kù)。雖然聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）仍然是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)DNA擴(kuò)增技術(shù)，即使是高保真的PCR技術(shù)在從單個(gè)基因組為模板進(jìn)行復(fù)制時(shí)也會(huì)引入數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的錯(cuò)誤。這就是為什么大多數(shù)單細(xì)胞DNA測(cè)序現(xiàn)在依賴于多重置換擴(kuò)增（MDA）的原因。
MDA在恒定溫度下工作，不需要有序列特異性的引物，并且很少引入錯(cuò)誤。“多重置換技術(shù)使用的酶具有很高的流變性，也是一種非常高保真的酶。所以我們可以在這個(gè)過程中保證基因組得到一致的覆蓋率……和非常高的序列復(fù)制準(zhǔn)確性。”Langsdorff說。
DNA擴(kuò)增結(jié)束后，研究人員就可以進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序了。即使基因組測(cè)序的價(jià)格下降到每個(gè)人類基因組1000美元以下，但對(duì)數(shù)十或數(shù)百個(gè)單個(gè)細(xì)胞的基因組測(cè)序顯然也很昂貴，這凸顯了事先仔細(xì)選擇和處理細(xì)胞的重要性。盡管如此，在嘗試識(shí)別變異之前對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序仍至關(guān)重要。那是因?yàn)閱渭?xì)胞DNA測(cè)序的深度通常很淺，一般只有1倍或更少。“然后你需要對(duì)比一下……你已經(jīng)建立的所有測(cè)序庫(kù)。只有當(dāng)一種突變同時(shí)出現(xiàn)在多個(gè)庫(kù)中時(shí)，你才能將其稱為突變。” Langsdorff解釋道。
盡管與單細(xì)胞RNA研究相比，單細(xì)胞DNA測(cè)序仍面臨挑戰(zhàn)。但顯然，它越來(lái)越受歡迎了。研究人員已經(jīng)在使用單細(xì)胞分析技術(shù)來(lái)識(shí)別腫瘤和組織內(nèi)的基因突變，Langsdorff說這項(xiàng)技術(shù)也很快在微生物學(xué)領(lǐng)域站穩(wěn)腳跟。
非自然選擇下的突變
使用者需要比較多個(gè)細(xì)胞的DNA序列來(lái)鑒別真性遺傳突變和人為誤差，這限制了單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用潛力。對(duì)于想要識(shí)別單核苷酸突變的研究人員來(lái)說，這是一個(gè)特別嚴(yán)重的問題。最近的報(bào)道指出，傳統(tǒng)的細(xì)胞分離和基因組擴(kuò)增策略，即使是MDA，也會(huì)在人類基因組中引入多達(dá)上百萬(wàn)的假陽(yáng)性單核苷酸突變，超過了真正的陽(yáng)性突變（1）。
這些差錯(cuò)大部分源于研究人員習(xí)慣使用的細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)流程。“當(dāng)你進(jìn)行細(xì)胞裂解和DNA變性時(shí)，會(huì)引入一種叫做脫氨胞嘧啶的人為突變，這是由過程中的加熱步驟造成的。”加州丘拉維斯塔的Novogene公司的全球市場(chǎng)總監(jiān)Joyce Peng解釋說。但最近紐約的SingulOmics公司的研究人員開發(fā)了一種新的技術(shù)，可以避免對(duì)細(xì)胞和DNA進(jìn)行加熱。將該方法與高保真MDA擴(kuò)增相結(jié)合，可以將假陽(yáng)性率降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
SingulOmics和Novogene正在合作，他們把完整的單細(xì)胞基因組工作流程作為一項(xiàng)服務(wù)。研究人員可以將他們的細(xì)胞送到SingulOmics進(jìn)行樣品制備和基因組擴(kuò)增，然后再將擴(kuò)增后的DNA送到Novogene進(jìn)行測(cè)序。一旦測(cè)序完成，SingulOmics還可以提供數(shù)據(jù)分析服務(wù)。過程的兩個(gè)部分也可以單獨(dú)進(jìn)行。傾向自己進(jìn)行測(cè)序和分析的研究人員可以在這個(gè)過程中略過Novogene，而單純地獲取來(lái)自SingulOmics擴(kuò)增的DNA。而那些能夠輕松分離細(xì)胞，只需要測(cè)序的客戶，就可以直接去Novogene公司。“有兩類客戶。一類是按照我們的講解，自己分離細(xì)胞；另一類是由我們分離細(xì)胞，所以他們只需要提供一個(gè)細(xì)胞懸浮液。”來(lái)自Novogene的Peng介紹。
雇傭外包公司來(lái)處理整個(gè)過程對(duì)單細(xì)胞測(cè)序新手來(lái)說尤其有效。因?yàn)榉⻊?wù)提供商“為了完善這些技術(shù)，犯過很多錯(cuò)誤，花過很多錢，”Peng強(qiáng)調(diào)，研究人員應(yīng)該“為了節(jié)約時(shí)間而雇傭服務(wù)提供商”。
單細(xì)胞DNA工作的新手為了適應(yīng)復(fù)雜和不斷發(fā)展的擴(kuò)增技術(shù)，可能也需要幫助。“有很多全基因組擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)流程，但有些研究人員不太清楚哪種流程對(duì)他們的研究最有利。”馬薩諸塞州坎布里奇的BGI的領(lǐng)域應(yīng)用專家Zonghui Peng介紹。
雖然MDA已成為鑒定單核苷酸突變類項(xiàng)目的首選擴(kuò)增方法，但尋找基因拷貝數(shù)突變的實(shí)驗(yàn)室通常更熱衷于一種稱為“多退火和環(huán)基擴(kuò)增循環(huán)”（MALBAC）的方法。與PCR一樣，MDA允許基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步擴(kuò)增的模板；但MALBAC只擴(kuò)增原始基因組的DNA。這使MALBAC成為精確計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中基因拷貝數(shù)的理想方法�；蚪M擴(kuò)增方法的多樣性凸顯了一個(gè)必要步驟的重要性，那就是在開始單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)之前，研究人員應(yīng)該有一個(gè)明確的科學(xué)問題。
需要仔細(xì)規(guī)劃實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)原因是成本。“全基因組、單細(xì)胞測(cè)序的成本與大量細(xì)胞測(cè)序的成本大致相同。”BGI的Peng解釋。由于研究人員不可避免地需要對(duì)樣本中的數(shù)十或數(shù)百個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，錯(cuò)誤或設(shè)計(jì)不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)可能很快就會(huì)吞噬掉大量經(jīng)費(fèi)。
與SingulOmics和Novogene一樣，BGI也提供一系列單細(xì)胞基因組學(xué)服務(wù)。“BGI能夠處理已經(jīng)分離的單個(gè)細(xì)胞和大批量細(xì)胞這兩種類型的樣品。”Zonghui Peng介紹�？蛻暨�可以讓BGI提供各種類型的對(duì)照樣本，并選擇他們想要的數(shù)據(jù)類型。“如果我們的客戶自己有能力做生物信息學(xué)分析，他們通常會(huì)要原始數(shù)據(jù)，否則我們會(huì)建議BGI來(lái)完成生物信息學(xué)分析。”他補(bǔ)充道。
與業(yè)內(nèi)其他人一樣，BGI的Peng也強(qiáng)調(diào)了從一開始就認(rèn)真處理樣品十分重要。他還建議對(duì)部分樣本進(jìn)行普通的大量細(xì)胞測(cè)序，以便與單細(xì)胞DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
BGI和Novogene也都提供單細(xì)胞RNA測(cè)序服務(wù)。
個(gè)體與整體
隨著設(shè)備制造商和服務(wù)提供商試圖讓更多實(shí)驗(yàn)室能夠接觸到單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，這個(gè)領(lǐng)域里最前沿的研究人員正為這項(xiàng)技術(shù)開拓一片全新的疆土。對(duì)于單細(xì)胞DNA測(cè)序來(lái)說尤其如此，這個(gè)工具的潛在用戶剛剛開始探索。
雖然新技術(shù)提高了研究人員分離和擴(kuò)增單個(gè)基因組的能力，但另一個(gè)重大問題隨之逼近，它映射出了人們耳熟能詳?shù)恼w論和還原論之間的矛盾關(guān)系。“歸根結(jié)底，我們談?wù)摰氖巧锵到y(tǒng)——我們對(duì)單獨(dú)的一個(gè)細(xì)胞并不感興趣，我們感興趣的是如何通過分析許多個(gè)單細(xì)胞來(lái)幫助我們更好地理解整個(gè)系統(tǒng)。”加州大學(xué)舊金山分校藥學(xué)院的生物工程專業(yè)副教授Adam Abate說。例如，即使是對(duì)一個(gè)小腫瘤，要構(gòu)建一個(gè)完整的基因突變圖譜，也需要對(duì)數(shù)萬(wàn)億個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。“現(xiàn)在這根本不可能。”他表示。
然而，這也許很快就會(huì)成為可能。在最近的一項(xiàng)概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，Abate和他的同事對(duì)海水樣本進(jìn)行了單細(xì)胞基因組測(cè)序。“我們希望在不進(jìn)行任何培養(yǎng)的情況下，盡可能地獲取樣本中每個(gè)細(xì)胞的全基因組序列。”Abate說。通過這個(gè)項(xiàng)目，他們開發(fā)了一套高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程。只需單次運(yùn)行，就可以檢測(cè)到超過50,000個(gè)微生物細(xì)胞的部分基因組（2）。
這項(xiàng)技術(shù)在很大程度上依賴于定制化的微流控芯片。這種器件可以將細(xì)胞分離到單個(gè)的凝膠液滴內(nèi)，它使得研究人員在分離細(xì)胞的同時(shí)，裂解細(xì)胞并對(duì)其DNA進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，這些液滴與另一組含有寡核苷酸條形碼的液滴合并。盡管這些條形碼與10X Genomics公司的RNA測(cè)序條形碼合成方式不同，但它們的作用是相似的。條形碼將對(duì)每個(gè)細(xì)胞基因組擴(kuò)增得到的片段與一個(gè)獨(dú)特的識(shí)別序列聯(lián)系起來(lái)。最后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)帶條形碼標(biāo)記的基因組進(jìn)行測(cè)序并分析數(shù)據(jù)。
盡管這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果允許Abate的實(shí)驗(yàn)室區(qū)分單個(gè)微生物物種，鑒定抗生素抗性基因，并發(fā)現(xiàn)毒性因子，但他認(rèn)為還有很大的改進(jìn)空間。“在每個(gè)基因組里，我們平均只能得到1%的覆蓋率，而且統(tǒng)計(jì)分布差異非常大。很多細(xì)胞的覆蓋率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過1%，還有很多細(xì)胞的覆蓋率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不到1%。”他解釋道。Abate的研究團(tuán)隊(duì)正在努力改進(jìn)這些統(tǒng)計(jì)方法，他位于加州南舊金山的公司Mission Bio，正在開發(fā)微流控芯片的商業(yè)化版本，以便讓其他研究人員能夠使用這項(xiàng)技術(shù)。
隨著成本的降低和方法的標(biāo)準(zhǔn)化，該領(lǐng)域的專家期待單細(xì)胞測(cè)序?qū)⒊蔀檗D(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)研究的新模式。研究人員不再需要在大塊樣品的整體分析和單個(gè)成分的簡(jiǎn)化分析之間做出艱難抉擇，而是能夠把這兩種方法結(jié)合起來(lái)，得到整個(gè)生物系統(tǒng)的綜合圖譜。“這是一項(xiàng)真正具有變革性的技術(shù)，它產(chǎn)生的影響在之前是絕對(duì)無(wú)法想象的，” Abate評(píng)價(jià)說�！�
（譯者李楠是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的副研究員。）
引用文獻(xiàn)：
1. X. Dong, et al., Nat. Methods14, 491-493 (2017), doi:10.1038/nmeth.4227.
2. F. Lan, et al., Nat. Biotechnol.35, 640-646 (2017), doi:10.1038/nbt.3880.
作者Alan Dove是常駐馬薩諸塞州的科學(xué)作家和編輯。
鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2017年11月2日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見http://www.sciencemag.org/features/2017/11/singles-seen-sequencing-gets-specific。