Madeline Lancaster曾是研究人類大腦發(fā)育和小腦畸形發(fā)病根源的博士后，她和她的實(shí)驗(yàn)室研究人員面臨著類似的問(wèn)題。例如，小鼠大腦并不像一個(gè)微型人腦一樣運(yùn)轉(zhuǎn)和發(fā)育，而大腦內(nèi)復(fù)雜的層級(jí)網(wǎng)絡(luò)也并不是由那些在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿底部生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)化產(chǎn)生的。
她真正需要的，是一個(gè)可以在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)和調(diào)控的小型器官。在2013年，Lancaster開(kāi)發(fā)了一種技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)：她從人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPS）中培育出了腦瀑樣組織[1]。這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵是選擇神經(jīng)干細(xì)胞，并將其植入一種由多種蛋白質(zhì)組成的凝膠中，這些蛋白質(zhì)通常是在細(xì)胞周圍的強(qiáng)化區(qū)和滋養(yǎng)區(qū)中發(fā)現(xiàn)的。通過(guò)仿造這個(gè)被稱為“細(xì)胞外基質(zhì)”（ECM）的區(qū)域，可以培養(yǎng)干細(xì)胞在3D空間中生長(zhǎng)。這些細(xì)胞自發(fā)地發(fā)育成與煮熟的蛋清相似的小型大腦，同時(shí)具有了胚胎人類大腦的特定分層和組織特征。
Lancaster目前在位于英國(guó)劍橋的醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology）工作，是一個(gè)科研團(tuán)隊(duì)的負(fù)責(zé)人，她介紹說(shuō)他們正在為細(xì)胞提供3D培養(yǎng)的基質(zhì)，從而激發(fā)他們的自組裝本能。她的小組進(jìn)一步簡(jiǎn)化了該流程，用她的話說(shuō)就是 “在任何標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中都能產(chǎn)生腦瀑樣組織” 。
通常為了進(jìn)行科學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)室中的傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)方法往往依賴于永生化的腫瘤細(xì)胞系，但是這些細(xì)胞系的使用會(huì)伴隨一些比較嚴(yán)重的問(wèn)題，即在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)多年的傳代而積累的突變和來(lái)自其他細(xì)胞類型的污染。此外在平整堅(jiān)硬的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)得到的細(xì)胞常常還會(huì)表現(xiàn)的很奇怪，比如最大程度的偏平化拉伸生長(zhǎng)。
新澤西紐瓦克有一家專門研究3D細(xì)胞培養(yǎng)試劑的生物科技公司，叫做TheWell Bioscience。他們公司的總裁兼首席執(zhí)行官John Huang表示：“許多備選藥物在2D培養(yǎng)中已經(jīng)取得了成功，因?yàn)榧?xì)胞形態(tài)是平的，故而容易受到藥物的攻擊。但一旦它們進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，藥物就會(huì)失效，因?yàn)?D和3D環(huán)境中的作用機(jī)理是不一樣的。”他同時(shí)還表示，許多細(xì)胞生物學(xué)家想要的是可以對(duì)各種各樣的患者細(xì)胞（健康細(xì)胞和疾病細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)的方法，并且使它們可以像在體內(nèi)原位一樣生長(zhǎng)，甚至形成多層和多細(xì)胞組織。
當(dāng)然，3D細(xì)胞培養(yǎng)也并非沒(méi)有挑戰(zhàn)。在科羅拉多大學(xué)波德分校（University of Colorado Boulder）工作的生物工程師Kristi Anseth是一個(gè)研究小組的負(fù)責(zé)人，她表示：“當(dāng)你將細(xì)胞放入3D環(huán)境中時(shí)，很難對(duì)它們進(jìn)行成像或免疫染色來(lái)查看某些蛋白質(zhì)是否存在，也很難在培養(yǎng)它們后重新捕獲這些細(xì)胞。”
但是Anseth自己和整個(gè)領(lǐng)域同行的直覺(jué)告訴她，3D培養(yǎng)對(duì)生物學(xué)更有意義，因?yàn)槲覀兩眢w中的絕大多數(shù)細(xì)胞都是這樣生長(zhǎng)的。目前許多公司也已經(jīng)涉足該領(lǐng)域，目的就是為了使3D細(xì)胞培養(yǎng)以及下游的細(xì)胞成像和檢測(cè)更加簡(jiǎn)便。
關(guān)注細(xì)胞支架
任何方式的3D細(xì)胞培養(yǎng)的第一步都是把細(xì)胞從硬塑料上取下來(lái)，放到更舒適的地方。Matrigel被稱作3D細(xì)胞基質(zhì)中的“貴婦”，它是30多年前由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）的內(nèi)部研發(fā)人員開(kāi)發(fā)的動(dòng)物源性基質(zhì)，開(kāi)始用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤細(xì)胞入侵研究，后來(lái)被Corning公司商業(yè)化。它來(lái)自富含ECM蛋白質(zhì)（如層粘連蛋白，膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖和許多生長(zhǎng)因子）的小鼠肉瘤。如此豐富的ECM蛋白質(zhì)對(duì)研究人員來(lái)說(shuō)是一種饋贈(zèng)，Lancaster的神經(jīng)干細(xì)胞在這個(gè)支架上生長(zhǎng)時(shí)就感覺(jué)賓至如歸。但是由于在實(shí)驗(yàn)中引入了未知的生物成分，也成為了一種限制。同時(shí)，Matrigel也必須依靠冷藏來(lái)保持液態(tài)，在10℃時(shí)就會(huì)開(kāi)始形成凝膠，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程都要求在冷室中進(jìn)行。
位于馬薩諸塞州波士頓的Corning Life Sciences公司的副總裁兼總經(jīng)理Richard Eglen表示，在Matrigel中加入合適的生長(zhǎng)因子后，許多細(xì)胞茁壯成長(zhǎng)，例如肝細(xì)胞可以發(fā)育成肝臟瀑樣組織。Eglen說(shuō)：“Matrigel幾乎領(lǐng)先于那個(gè)時(shí)代，在很多情況下，你會(huì)得到正確分化的細(xì)胞，它們就像在體內(nèi)一樣開(kāi)始自我組織。”
TheWell Bioscience公司提供了一種比Matrigel更易于使用的極簡(jiǎn)版水凝膠。非動(dòng)物來(lái)源的多糖VitroGel 3D在室溫下是穩(wěn)定的，只有添加了含有鈣或鈉離子的培養(yǎng)基時(shí)，才開(kāi)始聚合成凝膠。Huang說(shuō)典型的水凝膠只需要10~15分鐘就能形成，混合步驟也十分簡(jiǎn)單。
VitroGel 3D可作為一種柔軟的2D涂層，亦可用作嵌入細(xì)胞的3D基質(zhì)，或作為動(dòng)物研究的注射劑。它的二代產(chǎn)品叫做VitroGel 3D-RGD，含有可以與大多數(shù)粘附性細(xì)胞的表面結(jié)合的位點(diǎn)。Huang介紹說(shuō)，讓研究人員知道VitroGel 3D不含任何不必要的生物成分是一個(gè)額外的賣點(diǎn)。研究人員可以調(diào)整培養(yǎng)基的成分來(lái)構(gòu)建一種水凝膠，這種水凝膠可以包含他們想要的任何配體或生長(zhǎng)因子，以影響其中的細(xì)胞。
位于瑞士巴塞爾的Lonza Bioscience Solutions公司的Lubna Hussain是負(fù)責(zé)原代細(xì)胞和3D細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理，他建議研究人員“要知道你的最終目標(biāo)是什么，并且在3D細(xì)胞培養(yǎng)工作中使用逆向思維。”Lonza的RAFT（Real Architecture For 3D Tissue）3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含了大鼠膠原蛋白，這些膠原蛋白是在凝膠過(guò)程中支撐細(xì)胞的介質(zhì)，同時(shí)以24或96孔吸收劑來(lái)濃縮膠原蛋白。將細(xì)胞與膠原蛋白和膠凝劑混合后，置于培養(yǎng)基頂部的吸收劑會(huì)吸收過(guò)量的膠原蛋白。最終的結(jié)果是形成一個(gè)嵌有細(xì)胞的“隱形眼鏡狀結(jié)構(gòu)”，這一過(guò)程大約需要一個(gè)小時(shí)的時(shí)間來(lái)完成。Hussain說(shuō)RAFT系統(tǒng)創(chuàng)造了一個(gè)高密度的環(huán)境，即每毫升體積內(nèi)的膠原蛋白高達(dá)80毫克，這更接近于體內(nèi)細(xì)胞周圍的ECM環(huán)境。
RAFT系統(tǒng)允許研究人員建立各種類型的培養(yǎng)方法，將細(xì)胞嵌入基質(zhì)中，在凝膠基質(zhì)的頂部分層進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，或兩者兼而有之。研究人員可以通過(guò)插入工具來(lái)建立包含氣液界面的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，例如皮膚或呼吸道上皮細(xì)胞。Hussain介紹說(shuō)研究人員已經(jīng)開(kāi)始創(chuàng)造性地建立共培養(yǎng)模式來(lái)將癌細(xì)胞嵌入到一個(gè)薄片中，然后將免疫細(xì)胞分層排列在薄片上，以研究它們是如何滲透到腫瘤內(nèi)的。
幾何結(jié)構(gòu)意義重大
有時(shí)候研究人員會(huì)希望細(xì)胞在3D環(huán)境中生長(zhǎng)，同時(shí)仍兼具在液體中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的便利性。微載體的出現(xiàn)使得這個(gè)問(wèn)題得以改善，可以做到兩全其美。Global Cell Solutions是一家提供3D細(xì)胞培養(yǎng)工具和細(xì)胞檢測(cè)方法的公司，該公司利用全局性真核細(xì)胞微載體（GEM）系統(tǒng)在直徑75到150微米的藻酸鹽磁珠表面進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)。這些光學(xué)透明的球體可以像水一樣進(jìn)行抽取而且內(nèi)部含有鐵磁顆粒，以便于磁吸懸浮或在試管中收集。弗吉尼亞Charlottesville公司的聯(lián)合總裁Robin A. Felder解釋說(shuō)，這些小珠上涂有“五種仿生涂層”，即纖連蛋白，明膠，膠原蛋白，Matrigel和聚賴氨酸等。
Felder說(shuō)，GEM漿液“既提供了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所具有的各種優(yōu)勢(shì)，也會(huì)使細(xì)胞在仿生多孔表面進(jìn)行定向生長(zhǎng)”。這意味著，在GEM中生長(zhǎng)的細(xì)胞與2D中生長(zhǎng)的細(xì)胞不同，它們可以表現(xiàn)出在體內(nèi)才會(huì)看到的表面特征，例如人腎細(xì)胞上的大量微絨毛。Felder表示:“細(xì)胞喜歡濕軟彎曲的表面，這樣它們就不會(huì)覺(jué)得自己和身體表面分開(kāi)了。”
此外，F(xiàn)elder還指出，GEM上生長(zhǎng)的細(xì)胞在用于觀察2D培養(yǎng)細(xì)胞的傳統(tǒng)成像系統(tǒng)中很容易操作，包括電子顯微鏡和熒光共焦顯微鏡。3D磁珠為觀察細(xì)胞的側(cè)面提供了罕見(jiàn)的視角，通常在2D平面培養(yǎng)中細(xì)胞的這個(gè)面是很難看到的。而且增加的GEM表面積允許在擁塞的50毫升管中培養(yǎng)多得多的細(xì)胞。Felder同時(shí)補(bǔ)充道，Global Cell Solutions正在開(kāi)發(fā)一個(gè)機(jī)器人系統(tǒng)，可以自動(dòng)進(jìn)行32個(gè)獨(dú)立的GEM細(xì)胞培養(yǎng)皿的護(hù)理和營(yíng)養(yǎng)供給。
一個(gè)無(wú)須凝膠的體系
通常在進(jìn)行其他檢測(cè)之前，要先把在基質(zhì)、凝膠或凝膠微載體上生長(zhǎng)的細(xì)胞分離出來(lái)。這需要完全或部分溶解細(xì)胞支架，或用酶解方法將細(xì)胞剝離出來(lái)——所有的過(guò)程都可能會(huì)以某種意想不到的方式干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)。很多時(shí)候，研究人員希望看到他們想要的細(xì)胞在沒(méi)有支架干擾的情況下，在3D空間中生長(zhǎng)時(shí)的表現(xiàn)是怎樣的。無(wú)支架技術(shù)帶來(lái)的好處是不引入任何物理或者化學(xué)上可能影響細(xì)胞的東西。但直到最近，無(wú)支架的3D培育技術(shù)還很棘手，而且穩(wěn)定性較差。
在無(wú)支架的3D細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞與相鄰的細(xì)胞相互連接，開(kāi)始形成自己的原生ECM，并形成一個(gè)細(xì)胞球。一種主流的方法是利用重力和細(xì)胞培養(yǎng)基上的“懸滴”。另一種誘導(dǎo)細(xì)胞形成球體的方法是把它們鋪在特殊的“超低附著”培養(yǎng)皿中�，F(xiàn)在，技術(shù)的革新使得培育細(xì)胞球的方法較之以前變得更簡(jiǎn)單、更穩(wěn)定、更安全，從而不再有包含珍貴細(xì)胞的懸滴丟失。
Corning的細(xì)胞球微孔板在96孔板和384孔板中提供超低附著表面和U形孔底。在自動(dòng)成像的過(guò)程中，黑邊透明底的微孔板可以確保細(xì)胞球的位置和尺寸的重現(xiàn)性。
Timothy Spicer表示說(shuō)，Corning孔板的使用，使得他們更加有可能在3D培養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行高通量篩選（HTS）以發(fā)現(xiàn)新藥。Timothy Spicer是佛羅里達(dá)州朱庇特斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）的先導(dǎo)化合物鑒定（ID）部門工作，他負(fù)責(zé)管理探索生物學(xué)及高通量篩選平臺(tái)，這是一個(gè)向所有斯克里普斯研究所研究人員和外部合作者開(kāi)放的公共技術(shù)平臺(tái)。
Spicer一直在與Corning公司合作完善1536孔細(xì)胞球微孔板的原型，這是最便于進(jìn)行自動(dòng)化高通量篩選的方式，可以實(shí)現(xiàn)小型化，而且節(jié)約成本。在一項(xiàng)使用HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系的研究中，Corning和Scripps的研究人員通過(guò)利用一個(gè)包含3300多種已知藥物分子文庫(kù)進(jìn)行篩選，直接對(duì)比了在2D環(huán)境中生長(zhǎng)的細(xì)胞和生長(zhǎng)成球狀的細(xì)胞團(tuán)。3D篩選中展現(xiàn)出效果的藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于2D篩選，這意味著在3D培養(yǎng)中只有很少的藥物可以產(chǎn)生與2D培養(yǎng)中同樣的細(xì)胞毒性水平[2]。
Spicer說(shuō)：“在不遠(yuǎn)的未來(lái)，我們可以取出源自患者的腫瘤細(xì)胞，將它們放入這些細(xì)胞球微孔板中，通過(guò)培育觀察并進(jìn)行化合物庫(kù)篩選。在幾天之內(nèi)，就能找到對(duì)殺死癌細(xì)胞最有效的藥物。
同樣是在細(xì)胞球微孔板市場(chǎng)上競(jìng)爭(zhēng)，瑞士蘇黎世的3D微組織公司InSphero擁有一套雙板系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，使懸滴培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑿徒M織。該公司的全球營(yíng)銷總監(jiān)Randy Strube表示，細(xì)胞模型越復(fù)雜，懸滴系統(tǒng)就越適合它。在這種系統(tǒng)中，重力和自組裝會(huì)驅(qū)使微組織在富氧環(huán)境中形成。
InSphero的GravityPLUS培養(yǎng)板使懸滴變得簡(jiǎn)單穩(wěn)定，并且很方便在96孔格式中進(jìn)行轉(zhuǎn)移。通過(guò)在每個(gè)微孔內(nèi)設(shè)置一個(gè)獨(dú)特的沙漏型通道，平板可以保持懸滴的穩(wěn)定，而且可以從外界移入培養(yǎng)基或更多的細(xì)胞。一旦細(xì)胞球或3D微組織形成，就可以很容易地把它們轉(zhuǎn)移到匹配的GravityTRAP型96孔板內(nèi)。GravityTRAP是細(xì)胞球培養(yǎng)板，具有圓錐形平底孔和保證移液時(shí)不擾動(dòng)細(xì)胞球的專用凸臺(tái)。該裝置使得研究人員能夠以一種可重復(fù)且小型化的方式，生產(chǎn)出無(wú)支架的復(fù)雜微組織。
更多的維度
對(duì)于那些不想花幾個(gè)月時(shí)間開(kāi)發(fā)自己的3D培養(yǎng)系統(tǒng)的科研人員來(lái)說(shuō)，InSphero還為藥物研發(fā)人員提供了已經(jīng)預(yù)先驗(yàn)證和檢測(cè)的微組織。InSphero目前生產(chǎn)多種不同類型的微組織，主要集中在毒理學(xué)研究用的肝臟模型，糖尿病研究用的胰島，以及用于腫瘤研究的腫瘤—基質(zhì)共培養(yǎng)微組織。
無(wú)獨(dú)有偶，Hussain介紹說(shuō)，Lonza的人類原代細(xì)胞將科研人員的大量時(shí)間精力從提取患者樣品并從頭進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)中解放出來(lái)，可以為他們節(jié)省平均6個(gè)月的時(shí)間。她同時(shí)也補(bǔ)充道，研究人員僅需從21種細(xì)胞類型家族中的一個(gè)中得到冷凍保存或新鮮的細(xì)胞，就可以輕松地開(kāi)始進(jìn)行科研工作。
Anseth表示， 3D培養(yǎng)的最終目標(biāo)并不只是精確地再現(xiàn)人體的復(fù)雜性。為了解釋這一點(diǎn)，她利用飛行作為類比：“飛機(jī)會(huì)飛，并不是因?yàn)樗鼈兛雌饋?lái)像鳥(niǎo)，而是因?yàn)槲覀儗?duì)飛行的機(jī)制了解得夠多。”她的觀點(diǎn)是，對(duì)3D環(huán)境下細(xì)胞系統(tǒng)或生命過(guò)程“足夠”了解，就有可能在生命過(guò)程出錯(cuò)或促進(jìn)康復(fù)的過(guò)程中進(jìn)行適當(dāng)?shù)母深A(yù)。
眾多公司目前正致力于器官芯片或人體芯片的設(shè)計(jì)應(yīng)用，這一技術(shù)可以讓研究者在實(shí)驗(yàn)室里用小型化的儀器對(duì)不同組織之間的交流進(jìn)行捕獲和調(diào)控，這預(yù)示著3D培養(yǎng)的下一場(chǎng)科技浪潮已經(jīng)悄然來(lái)襲。研究3D結(jié)構(gòu)隨著時(shí)間或不同的生長(zhǎng)因子增減過(guò)程的生長(zhǎng)和改變（也被稱為“4D細(xì)胞培養(yǎng)”），將會(huì)帶來(lái)可能加速康復(fù)或打破退行性進(jìn)程的新發(fā)現(xiàn)。
Hussain說(shuō)，研究人員對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的選擇就像在雜貨店里挑選麥片一樣，口味不同，選擇自然不同。她建議研究人員首先從他們想要回答的問(wèn)題開(kāi)始，然后逆向思考，以選擇最合適的技術(shù)。就像她說(shuō)的：“問(wèn)題是，你使用3D培育技術(shù)的具體應(yīng)用和目標(biāo)是什么?”■
引用文獻(xiàn)：
[1] Lancaster, M. A. et al., Nature 501, 373~379 （2013）.
[2]Madoux, F. et al., SLAS Discovery （2017）， doi: 10.1177/ 2472555216686308.
（譯者李楠是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員。）
Kendall Powell是美國(guó)科羅拉多州拉法葉的自由撰稿作者。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700114
鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2017年4月24日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見(jiàn)http://www.sciencemag.org/features/2017/04/adding-depth-cell-culture。