將外源分子注入單細胞以及對細胞內部做力學研究是細胞生物學的研究熱點之一，但是做到這些的前提是將針尖刺入到細胞內部。
然而，大量實驗表明，由磷脂雙分子層構成的細胞膜就像一道神奇的屏障，即便是比頭發(fā)絲細一千倍的納米針也很難刺入，成功扎透細胞膜的概率在20%~80%之間，有時候甚至怎么都扎不進去。小小細胞隱藏著諸多奧秘，細胞膜究竟具有怎樣的力學特性實在令人難以捉摸。
近日，電子科技大學機械與電氣工程學院教授彭倍團隊青年教師范娜博士從細胞生物力學的角度，為徹底解開這個謎團帶來了全新的思路，發(fā)現(xiàn)了納米針尖和細胞膜相互作用時的刺入機理，并找到了兩種大幅度提高刺入率的訣竅。
這項研究發(fā)表在國際著名期刊Small上，范娜為論文的第一作者，副教授姜海為共同第一作者，彭倍為論文聯(lián)合通訊作者，電子科技大學機械與電氣工程學院為研究的第一作者單位和通訊作者單位。
發(fā)現(xiàn)科學問題
刺入活體細胞，探究生命的奧秘是生命科學家的夢想。而如何給人體普遍存在的成纖維細胞注入藥物、蛋白質或轉錄因子，以誘導這些普通的細胞變成“萬能”的誘導多能干細胞，則成為越來越強烈的需求。
“設想一下，只要取一個成纖維細胞，比如普通的皮膚細胞，就可以誘導產生干細胞進而分化成完全沒有免疫反應的全新的眼角膜、全新的皮膚、全新的器官，這將是多么奇妙的事情！”范娜說，“這項技術一旦成熟，將會為人類的生命和健康事業(yè)帶來巨大的福祉！”
有了這一技術，人類研發(fā)和測試新藥就可以摒棄傳統(tǒng)的、飽受倫理詬病的動物活體試驗，而是通過體外培育特定的人體細胞組織來進行高通量的藥物測試。這樣既可以大大縮短測試新藥的時間，也可以更加準確地了解藥物的效用。
然而，細胞膜的存在給生命科學家進入細胞內部設置了一道巨大屏障。這層薄膜主要由磷脂雙分子構成，雖然厚度僅為8~10納米，但卻具有半透性且富有流動性。在針刺方法誕生之前，要想突破這層防線，就得派遣“比針尖還小一萬倍”的“特洛伊木馬”，即讓攜帶轉錄因子的病毒對細胞進行轉染。
但是，使用病毒轉染的方式存在致癌風險且轉染成功的概率僅為1%，尤其是很難區(qū)分哪些細胞已被轉染、哪些細胞未被轉染，轉染程度也無法進行精確的量化控制。因此，科學家逐步探索出了無病毒、非破壞性、可量化控制的新方法，即給細胞“打針”，直接把藥物、蛋白質或轉錄因子精準地注入單個細胞內部。
范娜在梳理學界給細胞“打針”的研究成果時發(fā)現(xiàn)，納米針要刺入細胞膜并不容易，刺入效率的范圍低時可至20%，高時可達80%，浮動區(qū)間很大。雖然生物學家已經注意到這個現(xiàn)象，但卻“知其然而不知其所以然”。
因此，她敏銳地意識到，生物力學的研究方法或許可以為解釋這個現(xiàn)象提供新的思路和科學依據，進而找到提高刺入率的有效方法，為生物學家探索細胞內部的奧秘提供理論和技術支持。
親自動手扎針
“紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行。”給細胞“扎針”到底有什么樣的力學特征？范娜認為，要了解這些信息，首先得自己動手扎一扎。納米針和成纖維細胞都很容易購買，在實驗室里完全可以重復前人的研究。
納米針的學名叫做原子力顯微鏡探針（AFM tip），其針尖直徑一般為20~100納米，小到肉眼根本無法看見。這種設備十分靈敏，可以測量到很微小的力——納牛（nN），我們手指輕敲鍵盤的力約為7億納牛。
有了靈敏的納米針，就可以開始給細胞“打針”了。研究人員先給納米針設定一個力值“開關”，然后從針尖接觸到細胞膜開始逐漸下壓，加載力也因此逐漸增加。當力的大小達到“開關”位置時，納米針就會立馬彈回來，這個力就是所謂的“觸發(fā)力”。
在逐漸用力的過程中，如果細胞膜沒有被刺破，就可以把觸發(fā)力提高一點再刺；如果細胞膜在某個力值被刺破了，力的變化曲線就會記錄下這個數值，這個數值就是“刺入力”。實驗中，范娜分別對30個活細胞進行針刺實驗，每個細胞重復刺4次，一共得到120組數據。通過統(tǒng)計刺入和沒有刺入的力曲線，得到了觸發(fā)力、刺入力與刺入率之間的關系。
她分別測量了觸發(fā)力為1納牛、3納牛、5納牛、8納牛時的刺入力，每個力值得到120組力曲線數據。通過分析、統(tǒng)計實驗數據，她發(fā)現(xiàn)：刺入力遠低于觸發(fā)力，而且，刺入率與觸發(fā)力也不成正比。
當觸發(fā)力為5納牛時，刺入率達到最高的15%；再增大觸發(fā)力，刺入力依然在1.3納牛附近徘徊，刺入率反而下降到了12.5%。也就是說，無論加載的力道或大或小，刺入力總是偏向于一個比較穩(wěn)定的值，不會隨觸發(fā)力的增加而增加。
按照一般的理解，扎針所用的力越大，肯定越容易扎透。如果畫一條曲線，那么，刺入力肯定是在加載力最大的時候刺破細胞膜的。然而，實驗數據表明，這個“常識”是不可靠的。
范娜提出了一個假說：在探針壓入細胞的過程中，細胞膜的應力不是持續(xù)增加的，可能存在分段的現(xiàn)象，細胞膜的應力達到一定的數值就保持不變了，只有這樣才能解釋刺入率不隨外界載荷增加而增加且刺入力遠小于觸發(fā)力的現(xiàn)象。
探秘細胞膜結構
既然把細胞想象成“皮球”無法解釋實驗數據，那么，細胞膜的應力變化和細胞膜的結構特征肯定還有其他的可能。為了解釋這種可能，范娜在大量實驗的基礎上，建立了細胞膜“骨架”模型，提出了“細胞膜應力分段效應假說”并加以實驗驗證。
然而，應力是“單位面積上的內力”，無法直接測量出來。因此，若要驗證猜想，需要構建合適的數值模型來準確計算。而要構建數值模型，首先得了解細胞的結構。
已有研究顯示，細胞膜下有一層肌動蛋白絲，像“柵欄”一樣把細胞膜分隔成許多隔室。不同類型細胞的肌動蛋白網格大小各有不同，范圍從30納米到230納米不等。早在1983年就有生物學家拍下了摩爾比為1：50的肌動蛋白/細絲蛋白網絡的電子顯微鏡照片。
再加上微管的支撐，細胞膜就神奇地有了“骨架”。范娜比喻說：“在微管和肌動蛋白絲的支撐下，細胞其實更像一頂帳篷。”
問題是，這種“骨架”結構對細胞膜應力的影響有多大？雖然在2010年已經有研究表明，細胞膜下的肌動蛋白絲可能對能否刺入十分重要，但是該項研究并沒有對此作出精確的量化描述。
經過實驗與有限元分析，范娜證實，由于細胞膜骨架具有網格結構，細胞膜在針刺過程中的應力呈明顯的分段現(xiàn)象（應力分段點S）。在應力分段點S之前，細胞膜的應力增加很快，之后趨于穩(wěn)定。如果細胞膜在S點之前不能刺入，就很難再刺入了。因此，要提高穿透率的最好方法，就是提高第一階段細胞膜的應力。
如何提高第一階段細胞膜的應力？原理其實很簡單，一種方法是增加細胞膜上的表面張力。研究人員給細胞表面刷了一層“膠水”——“鼠尾膠原I型蛋白”，這樣就把軟塌塌的細胞膜繃緊了一些，使其更容易被扎破。另一種方法是減少納米針與細胞膜之間的接觸面，通俗地說，就是讓針更細、更尖銳。
實驗顯示，沒有經過任何處理的細胞，刺入力為1.23±0.49納牛，刺入率只有13%；而給細胞涂上“膠水”之后，刺入力減小到0.86±0.32納牛，刺入率卻提升至39%；如果用更加尖銳的納米針，刺入力可減小到0.58±0.13納牛，刺入率高達70%。
執(zhí)著的信念
從2015底年開始關注這一問題，到2018年終于做出成果，范娜與團隊成員用了2年多的時間終于揭開了給細胞“扎針”的謎團。對此，論文評閱人給出了高度評價：“這是世界上第一次用細胞生物力學方法對細胞膜的應力給出精確、量化的描述。”
做出這項成果并不容易。2013年，范娜加入電子科大彭倍團隊，雖然此前在讀博期間接觸過生物力學，但她研究的主要方向還是髖關節(jié)的摩擦噪聲問題，深入到納米量級研究生物力學，對范娜來說還是第一次。最終，她選擇了一個生物力學和納米力學交叉的切入點——細胞。
“其實，我們課題組沒有一個老師有細胞研究方面的學術背景，更不用說開展這種活體單細胞研究了。” 范娜說，一切都是從零開始的：從零開始梳理文獻，從零開始學習請教，從零開始尋找合作。
沒有納米細針，就找上海的某研究所加工；不懂細胞刺入方法，就去重慶大學生物工程學院尋求合作。遇到難題或瓶頸，就找彭倍、姜海討論，并發(fā)動團隊內的博士、碩士一起想辦法，進行思想碰撞、頭腦風暴。
精準操控原子力顯微鏡給單個細胞“扎針”也是一個高難度的技術活。由于納米針很細、很脆而且價格不菲，因此，“扎針”時要求操作很穩(wěn)很準，否則針頭一旦折斷，買針頭的錢就打水漂了。設定每一個觸發(fā)力，都要進行預實驗和正式實驗，整個實驗下來，范娜給細胞“扎針”的次數就達到了成千上萬次。
由于實驗方案需要和合作單位共同商榷，因此，在做實驗的半年時間里，范娜經常往返于電子科大和重慶大學。后期的數據整理、統(tǒng)計和分析的工作量也非常巨大，團隊的博士生、研究生甚至本科生都積極參與了進來。光是論文的撰寫（包括圖片和圖表制作），范娜和姜海就足足修改了32遍。
論文投稿后，他們共收到3位審稿人的反饋意見。其中一位審稿人高度贊揚了這項工作；另一位審稿人對論文寫作的細節(jié)性問題提出了建議；還有一位審稿人從應用前景的角度提出質疑，認為納米針價格昂貴，難以推廣應用，該項研究意義不大。對此，范娜毫不膽怯，先后兩次據理力爭，向專家闡述了這項工作的重要意義，并最終說服了專家。2018年5月，論文最終得以在Small上發(fā)表。
“細胞生物力學是一個交叉學科，可以破解生物學家以前遇到的許多難題，至少可以提供新的視角和方法，為生命科學的研究提供有力幫助。”范娜引用“生物力學之父”馮元楨先生的話與所有的青年學人共勉：“聽從自己內心的聲音，永不放棄對未知的探索。生命不息，奮斗不止！”■
（作者單位為電子科技大學）