在過去的幾年里，分子生物學(xué)家們認(rèn)識到一個(gè)令人驚恐的事實(shí)：他們在實(shí)驗(yàn)中需要用到的一些關(guān)鍵性的試劑竟然效果不穩(wěn)定，以致于他們之前所做的大量工作的結(jié)果可能是錯(cuò)誤的。出現(xiàn)這個(gè)問題的主要原因在于抗體，這是研究人員從定量受體表達(dá)到純化關(guān)鍵基因產(chǎn)物一直都在使用的一類蛋白質(zhì)。
在過去，科研人員如果需要某個(gè)蛋白質(zhì)的抗體，他們要么自己制備，要么從同事那里獲得。雖然這很簡單，但過程卻乏味無聊，并且很花時(shí)間。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，這種手工方法再也無法給研究人員提供其所需的大量抗體。有需要就有市場，抗體生產(chǎn)行業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，以滿足日益增長的需求。然而事與愿違，低準(zhǔn)入門檻和巨大利潤的誘惑使得大量可疑的試劑很快就占領(lǐng)了市場�，F(xiàn)在，研究人員正在試圖找出問題原因并盡力改善現(xiàn)狀。
在加州圣地亞哥的One World Lab是一家主要致力于簡化抗體驗(yàn)證過程的抗體經(jīng)銷公司，他們的總裁兼首席執(zhí)行官M(fèi)ike Simson說：“我認(rèn)為這是一個(gè)日益嚴(yán)重的問題，因?yàn)樗鼰o處不在，每年都有數(shù)億美元的浪費(fèi)。在這一點(diǎn)上，市場上的可疑試劑現(xiàn)在已經(jīng)有失控的趨勢了。”
輕鏈，重鏈和供應(yīng)鏈
大多數(shù)科研人員不知道的是，很多供研究使用的抗體會沿著迷宮般的供應(yīng)鏈進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。少數(shù)供應(yīng)商在自己的工廠里制造抗體，但多數(shù)知名供應(yīng)商的運(yùn)作方式則像百貨公司。如同中國深圳的大量工廠生產(chǎn)著世界上大部分的電子設(shè)備一樣，中國武漢也有眾多生產(chǎn)抗體的企業(yè)。供應(yīng)商購買這些產(chǎn)品，然后把自己的品牌和股票號碼放在上面做貼牌銷售。因此，看似是市場上有諸多品牌進(jìn)行競爭，為消費(fèi)者提供了多種產(chǎn)品選擇，但是實(shí)際上銷售的卻是一個(gè)比消費(fèi)者看到的要小得多的產(chǎn)品集合。
研究人員經(jīng)常是從某個(gè)供應(yīng)商購買了一種抗體，發(fā)現(xiàn)這種抗體并不適用于他們的研究，然后就換一下供應(yīng)商訂購另一種抗體產(chǎn)品，但是他們完全沒有想到它們本質(zhì)上是同一種產(chǎn)品。購買一種產(chǎn)品需要花費(fèi)數(shù)百美元，研究人員通常會在這些重復(fù)的購買行為中浪費(fèi)數(shù)千美元。更糟糕的是，當(dāng)一種抗體在發(fā)表文章時(shí)表現(xiàn)得足夠好時(shí)，下一批抗體可能會令人失望，研究人員也無法追蹤問題。“如果你的結(jié)果沒有可追溯性，你就沒有問責(zé)機(jī)制，那么你就沒有重現(xiàn)性。沒有重現(xiàn)性，就沒法談科學(xué)了，” Simson說。
為了解決這個(gè)問題，One World Lab提供了來自大約40家不同制造商的完全可溯源的抗體產(chǎn)品，并以樣品大小的試劑盒出售。研究人員可以針對特定的目標(biāo)訂購一組真正不同的抗體，然后對它們進(jìn)行測試并找出最適合它們的抗體。Simson稱這種做法對抗體制造商和研究人員都有好處，他說：“需要有這么一個(gè)地方，數(shù)據(jù)可以得到反饋，以便公司都能了解他們的產(chǎn)品效果如何。”
不幸的是，雖然研究人員似乎很珍視One World Lab的服務(wù)，但他們并不想為此買單。Simson說：“我們在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，研究人員購買抗體樣品試劑盒，對其進(jìn)行測試，并確定哪些試劑有效，然后就直接向制造商去購買了。他們應(yīng)該通過One World Lab來購買，以保持這個(gè)平臺可以生存。”令人遺憾的是，Simson的擔(dān)憂并非無的放矢，該公司最近宣布將關(guān)閉這項(xiàng)服務(wù)。Simson在公司網(wǎng)站上發(fā)布的一則公告中強(qiáng)調(diào)，盡管One World Lab的商業(yè)模式需要調(diào)整，但“產(chǎn)品的透明度和性價(jià)比對推動科學(xué)發(fā)展十分重要”。目前還不知道將來是否會有其他公司能夠更好地提供這一服務(wù)。
陽性選擇和陰性選擇
除了呼吁供應(yīng)鏈更加透明之外，該領(lǐng)域的許多專家還主張建立一套更正式的、全行業(yè)通用的標(biāo)準(zhǔn)來檢驗(yàn)這些試劑的質(zhì)量。人類蛋白質(zhì)圖譜項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人、瑞典斯德哥爾摩KTH Royal Institute of Technology生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的教授和創(chuàng)始人Mathias Uhlén說：“顯然，我們需要清晰的列出一些對研究人員來說更有用的試劑。”
Uhlén和他的同事在開發(fā)人類蛋白質(zhì)圖譜時(shí)需要考慮抗體驗(yàn)證的問題，該圖譜制備了數(shù)以千計(jì)的抗體來檢測蛋白質(zhì)在整個(gè)人體組織中的表達(dá)模式。Uhlén還倡議組建了抗體驗(yàn)證國際工作組（IWGAV），該工作組去年10月發(fā)布了擬定的指南。大約在同一時(shí)間，世界生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)研究所（GBSI）在加利福尼亞州太平洋格羅夫的斯洛瑪爾會議場舉辦了一次會議，并成立了工作組繼續(xù)討論這個(gè)問題。
IWGAV和GBSI制定的所有新標(biāo)準(zhǔn)都有兩個(gè)基本原則。Uhlén說：“抗體必須針對特定的應(yīng)用方式進(jìn)行驗(yàn)證。”例如，一種抗體適用于對凝膠中變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子印跡，無法作為證據(jù)推斷在非變性檢測中（比如熒光激活細(xì)胞分選）它同樣有效。其次，新標(biāo)準(zhǔn)要建立實(shí)驗(yàn)流程或者叫框架方案，用來規(guī)范一個(gè)抗體必須通過哪些測試才能確定可以進(jìn)行某種特定應(yīng)用。
每個(gè)框架方案使用不同的技術(shù)和方法來對抗體的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。例如，研究人員可以采用一種遺傳學(xué)方法，敲除或降低抗體假定目標(biāo)的基因表達(dá)，并檢驗(yàn)這是否消除了抗體的結(jié)合位點(diǎn)。另一種方法是利用待測試的抗體純化目標(biāo)蛋白，然后通過質(zhì)譜法確定蛋白的同一性。
盡管這些抗體驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的建立大體上都遵循了相似的原則，但仍存在一些爭議。其中一個(gè)爭論的焦點(diǎn)是驗(yàn)證結(jié)果是應(yīng)該劃定一條及格線，還是應(yīng)該給出一個(gè)榜單以便在相同的目標(biāo)和應(yīng)用中獲得不同抗體的評分來判斷它們彼此的相對效果。Uhlén傾向于前者，而GBSI則傾向于后者。
要讓科研人員就這些標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成一致已經(jīng)很困難，應(yīng)用它們就更難了。Uhlén的團(tuán)隊(duì)一直在系統(tǒng)地測試用于人類蛋白圖譜的所有抗體，看看它們是否符合新標(biāo)準(zhǔn)。Uhlén說：“我們的目標(biāo)是三到四年，也許五年后，我們將只有那些已經(jīng)被正式驗(yàn)證過的，至少通過蛋白質(zhì)圖譜中有一個(gè)框架方案測試的抗體；但這已經(jīng)需要大量的投入，我們正為此而努力。”
對于絕大多數(shù)尚未在新定義的標(biāo)準(zhǔn)下得到驗(yàn)證的商業(yè)化抗體，最終用戶可能需要自行處理。在尚未具備基因敲除或質(zhì)譜功能的實(shí)驗(yàn)室中，一種新的RNA原位雜交方法可能會對研究人員有所幫助。
RNA雜交傳統(tǒng)上是一項(xiàng)棘手的技術(shù)，但是一家總部位于加州紐瓦克的生物技術(shù)公司Advanced Cell Diagnostics（ACD）希望改變這一現(xiàn)狀。該公司的RNAScope系統(tǒng)使用特定的探針和標(biāo)記物來快速、穩(wěn)定地量化細(xì)胞或樣本中的RNA水平。雖然RNA的轉(zhuǎn)錄不能完全反映蛋白質(zhì)的表達(dá)，但研究者可以利用相關(guān)性作為檢驗(yàn)抗體的一種簡單方法。ACD市場副總裁Chris Silva表示：“RNAScope確實(shí)是一種驗(yàn)證蛋白質(zhì)表達(dá)的正交方法，它允許使用者將RNA轉(zhuǎn)錄量作為以后翻譯成的蛋白質(zhì)的前體來進(jìn)行驗(yàn)證。”目標(biāo)蛋白的抗體結(jié)合水平若明顯不同于其RNA水平，將為抗體的質(zhì)量問題提供早期預(yù)警。
研究人員還可以使用RNA分析技術(shù)來縮小靶蛋白的范圍，然后再根據(jù)需要來訂購相對昂貴的抗體。Silva表示他的公司可以在幾周內(nèi)為任何序列提供定制的RNAScope探針，來加速篩選值得進(jìn)行抗體研究的目標(biāo)蛋白。
保持命中率
盡管一些評論人士將目前的形勢描述為一場危機(jī)，但業(yè)內(nèi)資深人士認(rèn)為，這是一個(gè)由來已久的問題，只是終于引起了人們的注意。位于英國劍橋的Abcam公司新產(chǎn)品開發(fā)副總裁Alejandra Solache表示她不認(rèn)為這是一個(gè)新的問題。她解釋說：“我們用于抗體驗(yàn)證的新工具實(shí)際上讓我們更清醒地認(rèn)識到我們常用工具存在一些潛在缺陷，比如我們過去一直在使用的某些抗體。”
由于研究人員對抗體驗(yàn)證并不太重視，所以制造商對這個(gè)領(lǐng)域的興趣也不是很大。“研發(fā)抗體的大部分成本來自于驗(yàn)證；這可能是一些公司一直在努力降低成本而不太重視的地方，”Solache說。
Abcam的目標(biāo)是為抗體的生產(chǎn)和檢測制定高標(biāo)準(zhǔn)。Solache補(bǔ)充說提供高質(zhì)量的產(chǎn)品是他們公司的責(zé)任；隨著可以用于抗體驗(yàn)證的新技術(shù)的逐漸興起，他們正在嘗試在更大的范圍內(nèi)使用這些技術(shù)，這樣他們就能更好地評估這些產(chǎn)品。同時(shí)，Solache也表示他們公司已經(jīng)利用Uhlén和他的同事們所倡導(dǎo)的技術(shù)驗(yàn)證了許多抗體。
Abcam是市場上重要的“雜合型”抗體供應(yīng)商之一，他們的主營業(yè)務(wù)包括銷售他們自己研發(fā)的抗體和其他公司貼牌生產(chǎn)的抗體。Solache堅(jiān)稱他們會仔細(xì)選擇供應(yīng)商，并補(bǔ)充解釋要求供應(yīng)鏈完全透明是有問題的——供應(yīng)商通常會與制造商簽訂合同，禁止公開這種關(guān)系。她說：“我認(rèn)為，如果抗體的質(zhì)量很好，這種不透明就不一定是問題。我們需要先解決質(zhì)量問題。”
對于那些只關(guān)心在哪里能買到好抗體的研究人員來說，Solache給出的建議是尋找提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)的公司。無論是在公司網(wǎng)站或者獨(dú)立的評論頁面上，對于特定抗體的評價(jià)，都可以為抗體的選擇提供很好的參考。
像Abcam這樣的大供應(yīng)商在投資新的抗體驗(yàn)證技術(shù)時(shí)，小公司也會擔(dān)憂自己的問題，特別是那些專門從事抗體生產(chǎn)的公司。這些公司必須首先決定選用哪些抗原來開發(fā)抗體，并試著猜測它們的需求量有多大。伊利諾伊州羅斯蒙特市Proteintech公司的首席執(zhí)行官Jason Li說：“科學(xué)本身的定義決定了有人要從事前沿的研究工作。”這家公司專注于抗體，ELISA和蛋白質(zhì)。Li補(bǔ)充說：“科研人員需要一些抗體試劑來進(jìn)行他們自己的前沿研究，而這樣的試劑以前從來沒有人用過。對于制造商來說，這其實(shí)是一件非常困難的事情，因?yàn)闆]有人能夠預(yù)測科學(xué)的發(fā)展。”
這個(gè)難題使得抗體制造業(yè)在某些方面與電影和音樂行業(yè)相似�？贵w制造商推測哪些抗原可能成為受歡迎的目標(biāo)，進(jìn)而投資進(jìn)行其對應(yīng)抗體的開發(fā)，并進(jìn)行驗(yàn)證，然后看銷售情況。Li估計(jì)大約有一成被選中的抗體會脫穎而出，其他九成的抗體則會被打入冷宮。人們希望，這十分之一的命中結(jié)果帶來的利潤能夠?yàn)槲磥硎N抗體的開發(fā)提供資金，并使周期持續(xù)下去。
近年來，多種因素的影響導(dǎo)致這種營銷模式發(fā)生了動搖。Li說，抗體供應(yīng)商一直靠從制造商的利潤中分成，而導(dǎo)致先前為了快速回報(bào)而向抗體制造商投資的金主現(xiàn)在選擇撤資。隨著預(yù)算縮減，很容易發(fā)現(xiàn)哪里削減支出比較容易。“總投入中三分之二的錢是用來驗(yàn)證抗體，而制作一個(gè)抗體的花費(fèi)只有三分之一，”Li說。不透明的供應(yīng)鏈加劇了這個(gè)問題，使研究人員無法確定劣質(zhì)抗體的來源。
“解決這個(gè)問題的唯一方法就是增加透明度，”Li表示，他還提出了一個(gè)設(shè)想，在未來，“每個(gè)抗體的生產(chǎn)流程都能夠向研究人員進(jìn)行全方位開放，包括原產(chǎn)地，制作工藝流程，適用領(lǐng)域和局限性等。”
源頭上的改變
當(dāng)抗體制造商和供應(yīng)商在透明度和標(biāo)準(zhǔn)上苦苦掙扎時(shí)，研究人員也在嘗試另辟蹊徑。位于馬薩諸塞州丹佛市的科研和診斷試劑公司Cell Signaling Technology 的首席科學(xué)官Roberto Polakiewicz說：“抗體有好有壞；有知道如何使用它們的人，也有不知道如何正確使用它們的人。”
Polakiewicz解釋說，許多有經(jīng)驗(yàn)的研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如何通過尋找數(shù)據(jù)來搜索商業(yè)化抗體的有效性信息�？尚哦容^高的抗體供應(yīng)商現(xiàn)在通常會向科研人員提供數(shù)據(jù)，來介紹他們目錄中的每一種抗體是如何被驗(yàn)證的。有自主測試能力的實(shí)驗(yàn)室也可以自行檢驗(yàn)他們所訂購的抗體。在實(shí)驗(yàn)中計(jì)劃使用的特定實(shí)驗(yàn)流程也是采購中應(yīng)該考慮的因素。“例如，當(dāng)你使用免疫熒光法時(shí)，如果你使用的是錯(cuò)誤的固定方法或固定劑，即使是使用了很好的抗體，也可能會得到錯(cuò)誤的結(jié)果，”他說。
即使在實(shí)驗(yàn)結(jié)果被發(fā)表了以后，也不能忽視對抗體使用細(xì)節(jié)的記錄。“如果你想重復(fù)一篇論文中的結(jié)果，清楚所有方法的來龍去脈是尤為重要的，”Polakiewicz說。但是他也補(bǔ)充道，研究人員在這方面的記錄是參差不齊的。沒有報(bào)告抗體來源和貨號的論文其實(shí)很難重復(fù)。
批號也非常重要，但是往往會被忽略；作為一種生物產(chǎn)品，抗體的效果很容易隨批次而變化。好的供應(yīng)商往往津津樂道于宣傳他們的質(zhì)量控制程序。但為了獲得最大的可靠性，研究人員應(yīng)該嘗試用同一批次的抗體進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)。
對于抗體供應(yīng)商和研究人員來說，最終解決抗體驗(yàn)證問題的方法將是依靠科學(xué)研究的基本原理。“說到底，這更多的是要以扎實(shí)的研究為基礎(chǔ)，開發(fā)一種抗體并對其進(jìn)行驗(yàn)證，就像要做好一個(gè)實(shí)驗(yàn)一樣，需要正確的實(shí)驗(yàn)操作和合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，”Polakiewicz強(qiáng)調(diào)道�！�
（譯者李楠是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員。）
本文作者Alan Dove是馬薩諸塞州的一位科學(xué)作家和編輯。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700116
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會（www.aaas.org）發(fā)布在2017年9月14日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見http://www.sciencemag.org/features/2017/09/agreeable-antibodies-antibody-validation-challenges-and-solutions。