2018年11月，國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《自然—方法學(xué)》刊登了一篇來自美國(guó)著名生物醫(yī)學(xué)成像專家、2010年美國(guó)青年科學(xué)家與工程師總統(tǒng)獎(jiǎng)獲得者Hari Shroff教授的綜述文章。
在文章中，Shroff通過圖文表明，“海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡是最靈敏的結(jié)構(gòu)光超分辨率顯微鏡。與一般的結(jié)構(gòu)光超分辨率顯微鏡相比，其靈敏度高10倍以上，連續(xù)成像的張數(shù)也至少高一個(gè)數(shù)量級(jí)，因此能觀察到線粒體分裂時(shí)的內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)變化”。
得到Shroff高度贊譽(yù)的“海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡”其實(shí)出自中國(guó)科學(xué)家之手。
2018年，北京大學(xué)陳良怡團(tuán)隊(duì)聯(lián)合華中科技大學(xué)譚山團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》的這一研究成果，成功將光學(xué)顯微鏡的性能提升到了一個(gè)新的高度。
更靈敏 更清楚
細(xì)胞孕育著生命的本源，構(gòu)成了生命的最基本單元。在顯微鏡發(fā)明之前，人類對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)如同在黑夜中視物。光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)，讓人類第一次得以看清細(xì)胞內(nèi)豐富多彩的結(jié)構(gòu)。
“生命是世界上最復(fù)雜的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)形式，只有看見了生命運(yùn)動(dòng)的過程和疾病發(fā)生的原因，才能更有針對(duì)性、更有效地去治療這些疾病。因此，生物影像科技的發(fā)展將改變生物醫(yī)學(xué)和每個(gè)人的未來。”北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所研究員陳良怡告訴《科學(xué)新聞》。
自誕生至今，顯微鏡在300年間經(jīng)歷了多代迭代：從最初的光學(xué)顯微鏡到共聚焦顯微鏡，再到21世紀(jì)初的超高分辨顯微鏡……探索從未止步。
陳良怡及其團(tuán)隊(duì)研發(fā)出的這款海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡堪稱是目前世界上活細(xì)胞成像時(shí)間最長(zhǎng)、時(shí)間分辨率最高的超高分辨率顯微鏡，它適用于各種細(xì)胞、不同探針的熒光成像。
分辨率通常被認(rèn)作是光學(xué)顯微鏡的生命，而海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡可謂將這一點(diǎn)做到了“極致”。在每秒鐘得到188張超高分辨率圖像時(shí)，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的空間分辨率可達(dá)85納米，即能夠分辨單根頭發(fā)的1/600~1/800大小結(jié)構(gòu)，而其所需要的光照度卻小于常用的共聚焦顯微鏡光照度3個(gè)數(shù)量級(jí)。
也許通過對(duì)比更能清晰地顯示出海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的卓越性能。
比如，在觀察細(xì)胞內(nèi)囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜融合釋放神經(jīng)遞質(zhì)和激素這一過程時(shí)，雖然海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡與2014年摘得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)桂冠的STED顯微鏡均可以觀察到囊泡融合形成的孔道，但是前者在此基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步解析出了囊泡融合時(shí)的4個(gè)不同中間態(tài)：包括囊泡打開3納米小孔、囊泡塌陷、融合孔道維持以及最后的囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜完全融合，可謂真正實(shí)現(xiàn)了膜孔道形成全過程的可視化。
為什么能看得如此清楚？“它是基于一款鏡口率為1.7的物鏡來實(shí)現(xiàn)的。這款物鏡有兩個(gè)好處，第一是它能以最大的鏡口率去照明樣本，從而獲取更高的分辨率；第二是它可以以更大的角度接收熒光，從而獲得最大的對(duì)比度。”北京大學(xué)博士后黃小帥解釋說。
有了完美的物鏡還不夠，研究團(tuán)隊(duì)還需要一款與之相匹配的高折射率玻片。雖然目前國(guó)際上有一款藍(lán)寶石玻片能夠滿足需求，但其價(jià)格卻讓人望而卻步。
“這種玻片大約50美金1片，如果一天做10片細(xì)胞就需要500美金。”黃小帥告訴《科學(xué)新聞》。于是，研究團(tuán)隊(duì)基于硬件自主設(shè)計(jì)出了一款玻片，其性能完全可以比美藍(lán)寶石玻片，而成本卻只有后者的十分之一。
在實(shí)現(xiàn)超高分辨的同時(shí)，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的超高成像速度也被業(yè)內(nèi)津津樂道——它能實(shí)現(xiàn)每秒采集1692張?jiān)紙D像，而傳統(tǒng)的顯微鏡只能達(dá)到視頻級(jí)的成像速度。
之所以能夠做到這一點(diǎn)，其中一個(gè)重要原因在于研究者們不斷地嘗試優(yōu)化和逼近控制系統(tǒng)的極限。“我們的同步精度可達(dá)50納秒，基于自主設(shè)計(jì)的新偏振旋轉(zhuǎn)玻片陣列以及高精度的時(shí)序控制程序，通過每9張?jiān)紙D像就能得到1張高分辨的成像，從而實(shí)現(xiàn)188Hz時(shí)間分辨率的超分辨成像；通過每次變換3張圖像滾動(dòng)重構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)每秒564Hz的超分辨率重構(gòu)幀率。”北京大學(xué)博士研究生吳潤(rùn)龍介紹。
捕捉動(dòng)態(tài)過程
在超高分辨率和成像速度之外，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的低光毒性也非常出眾，這使得它能夠適用于細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器研究，尤其是那些對(duì)激光強(qiáng)度敏感的細(xì)胞器如線粒體。
“對(duì)于光學(xué)顯微鏡而言，空間分辨率比結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡更高的超分辨成像技術(shù)如STED，需要更多的光子數(shù)也就是更高的激光強(qiáng)度。而線粒體受到強(qiáng)激光會(huì)產(chǎn)生過多的活性氧，從而導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，不利于超分辨的成像。”北京大學(xué)博士研究生李柳菊告訴記者。
相比之下，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡對(duì)于線粒體嵴的成像結(jié)果更接近于電鏡。應(yīng)用海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡，研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了線粒體的超快、超分辨成像，首次在活細(xì)胞中解析了線粒體融合、分裂時(shí)內(nèi)嵴的活動(dòng)以及線粒體內(nèi)嵴自身的重組裝過程，并觀察到了活細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體發(fā)生相互作用時(shí)的動(dòng)態(tài)變化。要知道，此前無論是STED還是STORM都無法做到這一點(diǎn)。
也就是說，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡讓生物學(xué)家們觀察到了以前傳統(tǒng)熒光顯微成像技術(shù)從未觀察到的新的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)過程。
分子馬達(dá)是一類蛋白質(zhì)，它能將細(xì)胞內(nèi)的東西從一個(gè)地方轉(zhuǎn)運(yùn)到另外一個(gè)地方。雖然分子馬達(dá)的尺寸只有不到100納米，但它卻能以每秒鐘1000納米的速度快速運(yùn)動(dòng)，這就使得已有的顯微成像工具無法在活體狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。
但海森結(jié)構(gòu)光顯微成像技術(shù)的誕生解決了這個(gè)長(zhǎng)期以來困擾清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授歐光朔課題組的難題。
“它提供了前所未有的時(shí)間和空間分辨率，使我們看到了細(xì)胞里面從來沒有看到過的分子馬達(dá)運(yùn)動(dòng)的一些新的特征和行為。所以，海森結(jié)構(gòu)光顯微成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)家來講有著迫切的需求。”歐光朔表示。
佩梅病（PMD）是一種罕見的彌漫性腦白質(zhì)髓鞘形成障礙的X連鎖隱性遺傳疾病，其與兒童的發(fā)育遲緩以及腦白質(zhì)的發(fā)育落后有著密不可分的聯(lián)系。此前通過對(duì)致病機(jī)制的研究，研究者們一直認(rèn)為它是由蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴積后引發(fā)的，而海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的出現(xiàn)賦予了研究者們新的研究視角。
“我們應(yīng)用海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方面的研究，發(fā)現(xiàn)了一些新的形式；還發(fā)現(xiàn)佩梅病會(huì)伴隨線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)而變化，這是之前所不知道的。這些研究能夠加深我們對(duì)神經(jīng)遺傳病的發(fā)生、發(fā)展過程的了解，揭示可能的致病新機(jī)制。此外，通過尋找一些藥物新靶點(diǎn)，也有可能開辟篩選特定藥物治療這一類疾病的廣闊前景。”北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科教授王靜敏表示。
“生命本身是運(yùn)動(dòng)的，所以它的運(yùn)動(dòng)包含了所有信息。如果我們能看到它在活細(xì)胞內(nèi)是怎樣變化的，就有可能知道它在疾病產(chǎn)生時(shí)發(fā)生了怎樣的變化以及如何從一個(gè)狀態(tài)變到另外一個(gè)狀態(tài)。這是我們覺得最有價(jià)值的地方。”陳良怡表示。■