在短短20小時(shí)內(nèi)，斑馬魚(yú)胚胎就從一個(gè)單細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)擁有2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞能夠扭動(dòng)尾巴的生物體。自從Philipp Keller在2005年開(kāi)始讀博士時(shí)，他就想看看在如此之短的時(shí)間內(nèi)這一復(fù)雜的過(guò)程是怎樣實(shí)現(xiàn)的。由于胚胎細(xì)胞以每秒幾微米的速度移動(dòng)，他需要高速視頻來(lái)捕捉這一過(guò)程。
Keller說(shuō)，激光片層掃描顯微鏡是解決這個(gè)問(wèn)題的必要手段。他現(xiàn)在是位于弗吉尼亞州阿什伯恩附近的Janelia 科研園區(qū)的一名生物學(xué)和物理學(xué)專(zhuān)家。即使內(nèi)部光學(xué)系統(tǒng)并非完全如此，激光片層掃描顯微鏡的概念其實(shí)很簡(jiǎn)單，即一次照亮樣品的某個(gè)平面，拍攝寬場(chǎng)圖像，然后移動(dòng)平面。這種方法比典型的共聚焦顯微鏡逐點(diǎn)掃描快得多。與其他技術(shù)相比，它對(duì)單個(gè)細(xì)胞造成的光毒性更小。因此，對(duì)于很多對(duì)高速細(xì)胞活動(dòng)(如神經(jīng)元的放電或血細(xì)胞的流動(dòng))感興趣的科研人員來(lái)說(shuō)，激光片層掃描系統(tǒng)已經(jīng)帶來(lái)活細(xì)胞成像的下一波浪潮。其他推動(dòng)活細(xì)胞成像發(fā)展的技術(shù)還包括多光子顯微鏡和以拉曼顯微鏡和三倍頻成像為代表的無(wú)標(biāo)記成像方式。
“活細(xì)胞成像一直都是顯微鏡的終極用途。”位于德國(guó)耶拿的蔡司顯微鏡公司的應(yīng)用技術(shù)專(zhuān)員Christian Hellriegel這樣說(shuō)。他繼續(xù)解釋?zhuān)罴?xì)胞成像超越了生命的結(jié)構(gòu)，而觀察生命的過(guò)程，包括細(xì)胞或分子如何移動(dòng)，細(xì)胞如何對(duì)環(huán)境或鄰居作出反應(yīng)，以及大腦如何運(yùn)作或損傷如何愈合。
公司和科研人員們正在開(kāi)發(fā)一系列的工具，所有這些選擇可以歸結(jié)為以下三種，紐約州伊薩卡的康奈爾大學(xué)的應(yīng)用物理學(xué)專(zhuān)家Chris Xu說(shuō)。“每個(gè)人都想看得更深、更快、更寬。”
更深：多光子成像
為了在顯微鏡下看得更深，一個(gè)解決方案是多光子成像，位于英國(guó)劍橋的徠卡微系統(tǒng)公司的首席科學(xué)官Julian Burke說(shuō)。徠卡剛剛推出了SP8 DIVE顯微鏡，這是一個(gè)多色雙光子系統(tǒng)，可以深入觀察活體組織。訣竅是，它不再是用一個(gè)光子，而是用兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)光子來(lái)激發(fā)熒光團(tuán)。Burke說(shuō)，在最理想的條件下，這些更紅、更長(zhǎng)的光波可以穿透深達(dá)500微米的組織，因?yàn)樗鼈儾惶菀妆唤M織本身散射。它們的光毒性也更低，而且不容易令熒光團(tuán)淬滅，他補(bǔ)充說(shuō)。
法國(guó)勃艮第大學(xué)的化學(xué)專(zhuān)家David Monchaud因?yàn)槎喙庾映上竦木�、靈敏度和活細(xì)胞成像能力而被吸引。他研究DNA和RNA四聯(lián)體，這兩種核酸結(jié)構(gòu)最初是通過(guò)共聚焦顯微鏡在固定的死細(xì)胞中觀察到的。利用多光子顯微鏡，他可以確認(rèn)活細(xì)胞中存在四聯(lián)體，這表明它們可能在那里發(fā)揮某種功能。“這種顯微鏡是無(wú)價(jià)的，” Monchaud說(shuō)。
如果兩個(gè)光子很好，那三個(gè)光子會(huì)不會(huì)更好呢？這是Xu正在研究的問(wèn)題。通過(guò)利用三個(gè)波長(zhǎng)很長(zhǎng)的光子來(lái)激活一個(gè)熒光團(tuán)，他可以更深入地觀察活體樣本。在2017年，他報(bào)道了對(duì)1毫米深處老鼠神經(jīng)元放電的可視化。Xu說(shuō)，這種顯微鏡可以直接通過(guò)密集的光散射白質(zhì)成像，這是以前的顯微鏡無(wú)法做到的。他說(shuō)，一些實(shí)驗(yàn)室正在利用這項(xiàng)技術(shù)研究細(xì)胞遷移和神經(jīng)科學(xué)等課題。
更快：激光片層掃描技術(shù)
然而，多光子成像仍然依賴于速度較慢的逐點(diǎn)掃描。Xu說(shuō)：“速度和深度總是需要平衡的。” Keller想要在60~90秒內(nèi)掃描整個(gè)斑馬魚(yú)胚胎，所以激光片層掃描顯微鏡就成為了問(wèn)題的解決方案。
盡管激光片層掃描顯微鏡是一個(gè)古老的概念，蔡司顯微鏡公司的研究人員在1903年就首次提出了這個(gè)概念。但直到這個(gè)世紀(jì)，這些用于處理圖像體積的熒光標(biāo)簽才開(kāi)始匯聚在一起，使激光片層掃描技術(shù)成為主流。蔡司Z.1型激光片層掃描顯微鏡包括一個(gè)懸掛在物鏡前的培養(yǎng)槽，里面可以容納整個(gè)生物體（例如一只果蠅甚至是一只小章魚(yú)），而且可以方便地旋轉(zhuǎn)以獲得更好的視角。
Keller在2008年發(fā)明了一種被稱為數(shù)字掃描激光片層熒光顯微鏡（DSLM）的系統(tǒng)，使他得到了夢(mèng)寐以求的速度：每分鐘15億體素。這個(gè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)不同于常規(guī)的商業(yè)化顯微鏡。Kelle將激光和物鏡以正確的角度放在臺(tái)子上；然后，他將斑馬魚(yú)胚胎植入瓊脂糖中，并將瓊脂糖置于光源和物鏡之間的試管中。他通過(guò)在激光片層中前后移動(dòng)樣品，從而掃描所有平面。他觀察到了以前從未見(jiàn)過(guò)的斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育和胚層形成的實(shí)例。
從那時(shí)起，Keller革新了這項(xiàng)技術(shù)。另一個(gè)問(wèn)題是，如果樣品很大或不透明，激光片層可能無(wú)法穿透它。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Keller開(kāi)發(fā)了SiMView。他將激光片層和相機(jī)加倍，在20毫秒或更短的時(shí)間內(nèi)，即可收集4張圖像，因?yàn)槊總�(gè)相機(jī)可以快速連續(xù)地聚焦在兩張圖像上。
他解決的另一個(gè)問(wèn)題是各向異性，即一個(gè)目標(biāo)在橫向xy方向的分辨率通常比在軸向z方向的分辨率高。為了獲得在任意視角下具有相同分辨率的3D圖像，keller將相機(jī)和激光片層的數(shù)量再次翻倍至4個(gè)，并將這些圖像進(jìn)行數(shù)字組合，形成一種名為isoview的技術(shù)。
在馬里蘭州巴爾的摩的國(guó)家生物醫(yī)學(xué)成像和生物工程研究所，顯微鏡專(zhuān)家Hari Shroff也對(duì)神經(jīng)發(fā)育科學(xué)感興趣。他與來(lái)自康涅狄格州紐黑文的耶魯大學(xué)和紐約的斯隆—凱特琳研究所的科研人員合作，正在對(duì)線蟲(chóng)大腦的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行成像。
“這些蠕蟲(chóng)胚胎很難成像，而且對(duì)光線非常敏感，”Shroff說(shuō)。“你真的必須要快。”
他和他的同事們想要避免經(jīng)典的激光片層操作。在那種操作中，樣品被嵌入一管瓊脂糖，并被激光和照相機(jī)包圍。相反，他們更喜歡把蠕蟲(chóng)胚胎放在標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻片上。
為了保證入射的激光片層和物鏡之間的角度剛好合適，Shroff的解決方案是從垂直方向各傾斜45度。這個(gè)設(shè)備看起來(lái)很像一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡，除了載物臺(tái)上那兩個(gè)傾斜的物鏡。樣品保持靜止，來(lái)自兩個(gè)不同物鏡的激光片層連續(xù)移動(dòng)。該系統(tǒng)被稱為反向選擇平面照明顯微鏡（iSPIM）。
和Keller一樣，Shroff也處理了各向異性的問(wèn)題，但是他不是通過(guò)增加更多的物鏡。他只是簡(jiǎn)單地將它們分別設(shè)置為生成一個(gè)激光片層或收集一個(gè)圖像，并在兩者之間交替。首先，物鏡A生成激光片層，物鏡B獲取圖像，然后互換任務(wù)。研究人員稱這種布局為對(duì)稱雙視圖iSPIM（diSPIM）。
但是Shroff和他的同事們并沒(méi)有就此結(jié)束。還有另一個(gè)版本的儀器被他們稱之為三視圖SPIM，他們?cè)谏w玻片下面增加了一個(gè)額外的物鏡，以收集額外的輸出并提高空間分辨率，而不需要增加速度和激光強(qiáng)度。最后，研究人員通過(guò)在一個(gè)鏡像位置的蓋玻片進(jìn)行了diSPIM實(shí)驗(yàn)。這就在目鏡之外創(chuàng)建了一個(gè)“虛擬圖像”，就好像樣品和激光片層都加倍了。通過(guò)正確的算法，Shroff和他的團(tuán)隊(duì)可以從這些反射中獲取信息。其結(jié)果是在速度加倍的條件下進(jìn)行更加靈敏的成像，這一切都只是因?yàn)榧尤肓艘粔K鍍鋁的蓋玻片。
更寬：鮮活生動(dòng)的風(fēng)景
紐約哥倫比亞大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)工程師Elizabeth Hillman開(kāi)發(fā)了一種激光片層技術(shù)，這種技術(shù)只需要一個(gè)物鏡就能產(chǎn)生激光片層，并從樣本中收集所有信號(hào)。其樣本可以是一個(gè)完整的、自由移動(dòng)的生物體。該系統(tǒng)使用一面鏡子收集樣品中的光和相機(jī)焦點(diǎn)。她將她的系統(tǒng)稱為“掃描同軸平面激發(fā)”（SCAPE）顯微鏡。
與其他新的激光片層掃描技術(shù)一樣，SCAPE具有速度快的優(yōu)點(diǎn)。Hillman利用新型相機(jī)每秒可以對(duì)樣本成像100多幀。這使得她能夠?qū)η逍训摹⒁苿?dòng)的生物的細(xì)胞進(jìn)行成像，比如爬行的果蠅幼蟲(chóng)的閃爍神經(jīng)元，或者抽搐的斑馬魚(yú)的跳動(dòng)的心臟，而不會(huì)在動(dòng)物移動(dòng)時(shí)造成影像模糊。“我們的速度如此之快，以至于我們可以看到前所未見(jiàn)的時(shí)間信息。”
Hillman說(shuō)，SCAPE物鏡很容易適配各種類(lèi)型的樣品。這些細(xì)胞或生物體可能在培養(yǎng)皿中，甚至在老鼠的大腦里都沒(méi)關(guān)系。
哥倫比亞已經(jīng)將SCAPE技術(shù)授權(quán)給徠卡，雖然Burke還不確定徠卡的SCAPE系統(tǒng)將在何時(shí)面世。徠卡還獲得了另一種掃片技術(shù)斜平面顯微鏡（OPM）的授權(quán)。這是由倫敦帝國(guó)理工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)光學(xué)專(zhuān)家Chris Dunsby開(kāi)發(fā)的。
Dunsby的目標(biāo)是在保持良好分辨率的同時(shí)，進(jìn)行單物鏡的激光片層顯微鏡實(shí)驗(yàn)。他的技術(shù)使用三個(gè)顯微鏡連續(xù)放大樣品，從傾斜的平面捕捉光，并掃描激光片層。
Dunsby說(shuō)，整個(gè)裝置提供了高速、亞細(xì)胞分辨率的3D成像。例如，他將其與鈣追蹤染料一起使用，在大鼠心肌細(xì)胞中觀察可能在心力衰竭時(shí)觸發(fā)致命型心律失常的鈣離子濃度風(fēng)暴。“我們第一次能夠在三維圖像中看到，鈣離子波從心肌細(xì)胞中產(chǎn)生的具體位置。”他解釋說(shuō)。
OPM也適用于多孔板。Dunsby和他的同事曾用OPM和一個(gè)熒光生物傳感器來(lái)測(cè)量多細(xì)胞腎臟模型中葡萄糖的攝取情況。對(duì)42個(gè)孔里的樣品成像只花了9分鐘。
接下來(lái)呢？
SCAPE和OPM技術(shù)非�；パa(bǔ)，Burke說(shuō),徠卡計(jì)劃在即將發(fā)布產(chǎn)品上將它們合二為一。
活細(xì)胞成像的下一步是什么？Hellriegel說(shuō)：“我覺(jué)得我們還沒(méi)有發(fā)掘出激光片層掃描技術(shù)的全部威力。”例如，他認(rèn)為可以將超高分辨顯微技術(shù)整合到這一技術(shù)之中。
Burke預(yù)測(cè)，更多能夠標(biāo)志細(xì)胞事件(如神經(jīng)傳遞)的熒光蛋白和染料將使實(shí)時(shí)、快速成像對(duì)研究人員們具有巨大的吸引力。他還預(yù)計(jì)，為了進(jìn)行快速成像，速度更快、靈敏度更高的相機(jī)將成為必須研發(fā)的組件。
要不要熒光標(biāo)簽？
有時(shí)候，研究人員不愿使用熒光標(biāo)簽。首先，將它們引入樣品就很麻煩。也很難確定熒光團(tuán)是否準(zhǔn)確地反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的位置和活動(dòng)。標(biāo)簽可能無(wú)法有效地標(biāo)記蛋白質(zhì)，也可能隨著時(shí)間的推移被淬滅。
紐約城市大學(xué)亨特學(xué)院的生物物理學(xué)專(zhuān)家Hyungsik Lim使用三倍頻（THG）顯微鏡來(lái)對(duì)髓鞘（神經(jīng)線周?chē)慕^緣層）進(jìn)行成像。這項(xiàng)工作是在活細(xì)胞和組織中進(jìn)行的，而且不用任何熒光標(biāo)簽。當(dāng)三個(gè)入射光子能量結(jié)合到一個(gè)發(fā)射的光子中時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生三倍頻（THG）信號(hào)。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)組織邊界的折射率變化特別敏感。比如髓鞘這樣，處于水溶液和富含脂質(zhì)或蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)。
另一個(gè)選擇是拉曼顯微鏡，即拉曼光譜儀的掃描版。日本大阪大學(xué)的應(yīng)用技術(shù)專(zhuān)家Katsumasa Fujita正致力于將這一技術(shù)推廣到顯微鏡領(lǐng)域。拉曼光譜依賴單一波長(zhǎng)的入射光激發(fā)樣品中的不同分子。組成這束光的光子無(wú)論被樣品中的分子反彈還是折射，他們大部分會(huì)保持入射時(shí)的波長(zhǎng)。但是通常每一億個(gè)光子中會(huì)有一個(gè)在反彈之后發(fā)生光譜紅移，即變得能量較低，頻率向紅光區(qū)靠近。光譜紅移的程度取決于令光子發(fā)生散射的分子。拉曼光譜儀就是以這種方式鑒定樣品中的組分。
在生物顯微鏡上，拉曼散射的工作原理也是相似的，它能描述一個(gè)樣品中各分子成分的分布，無(wú)論是核酸、蛋白質(zhì)還是脂肪。但是，除此之外它無(wú)法進(jìn)行更深入的鑒別，例如它無(wú)法對(duì)不同的激酶進(jìn)行鑒別。
與此同時(shí)，紐約哥倫比亞大學(xué)的研究人員正努力將多種熒光標(biāo)簽加入拉曼成像的細(xì)胞樣品中。生物物理化學(xué)專(zhuān)家Wei Min指出，傳統(tǒng)熒光成像中最多可以同時(shí)使用大約五種熒光標(biāo)簽，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)的發(fā)射光波長(zhǎng)范圍較寬，容易彼此重疊。但在拉曼光譜中，發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍會(huì)變得更窄，因此應(yīng)該可以使用更多的熒光標(biāo)簽而不發(fā)生重疊。
Min過(guò)去的博士后Lu Wei，現(xiàn)在是帕薩迪納市加州理工學(xué)院的化學(xué)教授。她選擇接受這一挑戰(zhàn)。她和她的同事們?cè)O(shè)計(jì)了24種不同的熒光染料。通過(guò)變換分子中的碳碳三鍵、碳氮三鍵，以及同位素成分，他們創(chuàng)造出了不同的熒光基團(tuán)。
現(xiàn)在Wei和Min仍然在努力開(kāi)發(fā)更多的熒光染料，以及利用這些熒光染料對(duì)目標(biāo)生物分子或者細(xì)胞器進(jìn)行特異性標(biāo)記的方法。Min認(rèn)為也許至少50種標(biāo)簽才夠用。■
（譯者李楠是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員。）
作者Amber Dance 是加利福尼亞州洛杉磯的自由撰稿人。
鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2018年3月27日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見(jiàn)https://www.sciencemag.org/features/2018/03/live-cell-imaging-deeper-faster-wider。