六年前，負責為Ping Yeh治療的腫瘤科醫(yī)生告訴他，他的霍奇金淋巴瘤對標準的化療方案有耐藥性，他需要一種更有效的七藥雞尾酒療法。這種治療使他的癌癥得到了緩解，但之后Yeh需要進行超聲波檢查，看看這種治療是否損害了他的心臟（該療法對于部分患者是有心臟毒性的）。
“這種治療的確治愈了我，但它也可能在治愈我的同時殺死我。”Yeh解釋說，這是一次非�？膳碌慕洑v，它讓我思考是否有更好的方法來檢測藥物安全性。2014年，Yeh在明尼阿波利斯與人合作創(chuàng)辦了StemoniX公司，目的是將工程、制造和人體干細胞方面的進展結合起來，開發(fā)與人體生理學更具相似性的藥物篩選和測試平臺。
幸運的是，Yeh的心臟有驚無險。不幸的是，像Yeh這樣的病人經常遇到有毒或無效的藥物，因為在藥物進入病人體內之前用于測試藥物的動物模型在很多方面都是不完美的。在所有進入臨床試驗的藥物中，只有大約10%最終獲得批準(1)，其余90%的藥物在試驗中失敗——原因包括藥物脫靶、不良反應和劑量問題、低效或無效，以及最糟糕的情況“毒性”。
“你越是可以更好地模擬人體的情況，就越是可以更好地的研究和理解疾病的基本病理，同時也能更好地預測藥物的療效和毒性,” Richard Eglen說。他是位于馬薩諸塞州波士頓的康寧生命科學的副總裁兼總經理。
然而，現(xiàn)在面臨的挑戰(zhàn)是研究人員們需要設計出比當前策略具有顯著優(yōu)勢的模型。這意味著要建立能夠提供可靠、可重復數(shù)據(jù)的模型，同時在生物學上能幫助預測人體試驗的效果，而且不會大幅增加成本。StemoniX、康寧和其他幾家公司正在嘗試用創(chuàng)新的方法來應對這一挑戰(zhàn)。
細胞培養(yǎng)的高級結構
培養(yǎng)方法不斷改進，現(xiàn)在已經產生了三維細胞培養(yǎng)、球狀體，甚至更復雜的類器官，能更準確地模擬人體組織�？祵幑韭氏葹檠芯咳藛T提供了培養(yǎng)這些細胞的最好表面材料�，F(xiàn)在，該公司推出了1536孔的球狀體板，可以配合最高水平的自動化篩選平臺工作。底部為圓形的孔，其內壁涂有一層超低的附著表面，促使孔內的細胞相互聚集，形成球狀體。
“這將使研究人員能夠進行超高通量篩選，每天可篩選多達10萬種化合物，”Eglen說。這些板具有很小的孔體積，因此產生微小的球狀體，范圍從500到2000個細胞。它們提供與細胞數(shù)量成線性關系的可重復響應。
位于加州拉荷亞的斯克里普斯研究所的一個課題組已經在使用帶有胰腺腫瘤球狀體的平板，來識別這些細胞RAS致癌突變基因的抑制劑。以二維細胞培養(yǎng)為基礎的平行篩選并沒有發(fā)現(xiàn)相同的抑制劑(2)。康寧自己的研究使用人類肝球狀體對已知的肝毒素進行篩選，結果表明它們可以用于篩選肝臟毒性化合物。Eglen說：“每個人都希望在給病人用藥之前能夠更好地預測藥物的代謝情況。”
康寧公司還開發(fā)了另一項技術來支持間充質干細胞（MSCs）的三維培養(yǎng)。研究人員希望將MSCs（也稱為成人干細胞）開發(fā)成個性化的、基于患者細胞的治療方法，例如替換糖尿病中有缺陷的、用于產生胰島素的胰島細胞等。但是在原有條件下培養(yǎng)出足夠的間充質干細胞來，并將細胞送回病人體內是一個挑戰(zhàn)�？祵幑镜囊紫⑤d體技術使用惰性，非動物來源的聚合物制造微載體表面，從而使細胞以三維形態(tài)在這些位于培養(yǎng)液中的表面上生長。然后，通過添加酶，微載體可以被溶解，只留下MSCs以便進行分離。
人體細胞量產
StemoniX提供成品化的二維微心臟和微腦板，以及微腦三維球狀體板，用于高通量篩選，以提供精確的人體組織反應測試。該公司選擇將重點放在腦和心臟細胞上，部分原因是神經毒性和心臟毒性是藥物在臨床試驗中安全性失敗的兩個最主要原因。
微心臟中的細胞沿著微通道生長，形成類似于心臟肌肉的肉瘤單元結構，具有完整的物理標記、可形成正確的離子通道，并進行單向收縮。
二維和三維微腦中的細胞是星形膠質細胞和神經元的混合物，它們形成突觸和基本的神經網絡。二維培養(yǎng)是測量細胞形態(tài)變化的關鍵，比如神經投射。三維球狀體培養(yǎng)很難可視化，但它們表現(xiàn)出自發(fā)的、同步的神經放電，可以定量篩選影響放電的藥物反應。同樣，心肌細胞的收縮也可以定量測定藥物反應，如心律失常。
“沒有一個模型是完美的，”Yeh承認，但是他發(fā)現(xiàn)StemoniX的心臟和腦模型非常有用，“因為它們是人類細胞，結構正確，容易測量，并且以轉基因動物的一小部分成本提供更具預測性、更可靠和可重復的數(shù)據(jù)。”
微環(huán)境模擬
微圖案允許研究人員通過控制特定圖案或梯度下的信號分子，或生長因子來增加細胞培養(yǎng)的復雜性，但與在完整的動物模型中相比，這種方法對信號的影響更加容易控制。
雖然微圖案技術已經可以用于二維細胞培養(yǎng)，但目前的技術在設計梯度或分層兩個以上蛋白質方面還很粗糙。其中一種技術是微接觸打印，它使用浸在蛋白質溶液中的微型印章將蛋白印在培養(yǎng)物表面上，但在打印特定數(shù)量或排列方式的蛋白質時不夠精確。為了解決這些局限，法國國家科學研究中心（CNRS）的三位研究人員想出了PRIMO，一種用于微圖案的非接觸式、無掩模技術，并建立了Alvéole公司。
PRIMO是基于光誘導的蛋白質分子吸附技術（LIMAP），并結合了一個UV照明系統(tǒng)和光活性試劑。PRIMO的機箱可以附在倒置顯微鏡上，它包含一個紫外激光器和微鏡放映機。通過顯微鏡的物鏡，計算機里的任何圖像文件都可以被它以1.2微米的分辨率投影到細胞培養(yǎng)板的表面上。
載玻片、蓋玻片、塑料板、水凝膠等均可先用聚乙二醇（PEG）作為防污劑處理，然后在溶液中加入PLPP光引發(fā)劑。當與選擇投影圖案中的紫外線相遇時，PLPP會降解聚乙二醇，留下一個“凹槽”，由選擇的蛋白質填充。PRIMO的Leonardo軟件可以控制顯微鏡電動載物臺的移動，從而調整或切換圖案。此外，使用該軟件的256灰度級來改變紫外線強度讓研究人員能夠控制多少PEG被降解，從而控制多少蛋白質附著在表面。
在三維應用中，覆蓋在涂膜上的蛋白質微圖案可以轉移到水凝膠的表面，因為直接用紫外線照射水凝膠可以改變其硬度。研究人員還使用PRIMO涂覆在聚二甲基硅氧烷聚合物微球的底部和側面，以特定的三維結構培養(yǎng)肝細胞。另一個課題組還使用PRIMO將人類誘導多能干細胞（hiPSCs）培養(yǎng)成星形膠質細胞，并沿著細長的直線排列，以測量患有神經退行性疾病Rett綜合征患者的微管生長動態(tài)(3)。
“使用PRIMO，我們可以幫助研究團隊在短短幾周內嘗試獲得不同形狀和寬度的線條——而使用其他微圖案技術則需要幾個月的時間，”巴黎Alvéole公司的運營營銷經理Marie-Charlotte Manus說。
Manus說，這一系統(tǒng)還不能很好地用于高通量成像或篩選，盡管該公司正在開發(fā)一種用于多孔板的版本。目前，研究人員可以利用PRIMO更好的模擬體內微環(huán)境，即通過優(yōu)化他們中細胞培養(yǎng)中遇到的微圖形。
更精確的CRISPR模型
基因編輯技術將人類細胞培養(yǎng)帶到了一個全新的基因操作水平上，無論是對轉化細胞系、病人來源的原代細胞，還是誘導多能干細胞。雖然科研領域從倫理上無法接受制造基因敲除的人類，但像CRISPR/Cas9這樣的技術可以讓研究人員快速的從培養(yǎng)的人類細胞中敲除特定基因，然后篩選所需的特性。
“在后基因組時代，我們可以用以前從未想過的方式來審視生物系統(tǒng)，”英國劍橋Horizon Discovery公司的功能基因組篩查部門負責人Benedict Cross說。“從整個基因組的角度來看，系統(tǒng)方法很難在整個動物中合理控制。”
Horizon Discovery的CRISPR基因敲除篩選平臺可以敲除人類細胞群體中與特定過程（如凋亡）相關的每一個基因或一系列基因，然后測量這些被改變的細胞對藥物化合物的反應。它可用于識別新的藥物靶點，發(fā)現(xiàn)與藥物敏感性或耐藥性相關的基因，或選擇最適合進行臨床試驗的患者。
每一個CRISPR敲除引導RNA都針對它敲除的基因編碼了一個獨特的條形碼，所有的細胞都作為敲除的混合種群保存在一起，無論它們是在二維單層、三維球狀體中，還是懸浮狀態(tài)生長。一組細胞接受實驗性治療，如藥物，另一組作為對照。處理后的細胞被分離出來，并對其條形碼進行測序，以揭示其缺失的基因。
“在這一點上，它是相當精確和定量的，”Cross說�；驐l形碼的頻率越高，該基因的抑制作用就越有可能導致所需的生物活性。“這是一個全基因組水平分析的表型篩選。”
Horizon還調整了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，創(chuàng)建了另外兩個篩選平臺：CRISPR干涉（CRISPRi）和CRISPR活化（CRISPRa）。CRISPRi降低了基因表達水平，但沒有完全清除，而CRISPRa提高了目標基因的表達。
這三個CRISPR篩選平臺可以同時用于研究相同基因的敲除、功能喪失和功能獲得。Cross說：“當你能夠從兩個方向觀察，發(fā)現(xiàn)內源性激活和抑制某個通路的基因時，研究一個生物過程的能力就會得到極大的提高。”
基因編輯動物
通過2014年收購Sigma Advanced Genetic Engineering（SAGE）公司， Horizon Discovery還利用CRISPR技術，制作改良的“人源化”大鼠模型，用于藥物發(fā)現(xiàn)和安全測試。
正如位于密蘇里州圣路易斯市的Horizon Discovery體內研發(fā)小組的負責人Kevin Forbes所解釋的那樣，小鼠模型在藥物研發(fā)領域的崛起，與利用胚胎干細胞（ESC）技術進行基因敲除的易得性有關。然而，在此之前，大鼠是首選的模型，因為它們更大的體積允許多次抽血和更長期的化合物研究，而且它們的親社會行為和較慢的新陳代謝在生物學上更接近人類。
Horizon Discovery現(xiàn)在可以制作定制化的基因編輯大鼠、小鼠和兔子模型，修改范圍從小的點突變到大的片段缺失，包括敲出—敲入模型，在這個模型中，動物基因被人類基因取代。Horizon Discovery還擁有成品化的敲除大鼠模型，用于毒理學、腫瘤學和心血管疾病研究，以及研究神經疾病(包括自閉癥、帕金森病和阿爾茨海默病)的模型。
一個大鼠模型可以用來做藥物吸收、分配、代謝、排泄和毒理學（ADME/Tox）的研究，因為它經過基因編輯去除了大鼠三種核受體PXR、CAR、AHR和主要的藥物代謝酶細胞色素P450 CA4。這些受體起著異種感受器的作用，啟動細胞色素P450基因來代謝“外來”藥物。在這些ADME/Tox大鼠中，這四個基因的人類版本被重新編入。從理論上講，這些老鼠應該像人類小腸和肝細胞檢測藥物，以啟動代謝一樣發(fā)現(xiàn)新的藥物。
Forbes將CRISPR/Cas9描述為一種更高效、更快速的方法。與基于ESC技術的轉基因方法相比，在制造復雜的轉基因模型(如ADME/Tox大鼠)方面，估計CRISPR可使這一過程縮短一年。
這些“人源化”的大鼠將很快為臨床前藥物安全測試提供一個全動物解決方案，這比在體外用人類肝細胞進行測試要有用得多。例如，培養(yǎng)的細胞不會獲得身體其他部位形成的腫瘤，也不會發(fā)生藥物引起的心臟或認知問題。
當然，藥物開發(fā)可能永遠無法脫離對實驗動物的使用，因為它們代表了完整器官系統(tǒng)的生物復雜性，Yeh提醒道。但這些新技術將大大減少未來藥物測試所需動物的數(shù)量和種類。
隨著模型在“人源化”方面的改進，藥物開發(fā)人員應該能夠更好地預測化合物在人體中的作用，從而避免許多候選藥物注定面臨的失敗，并避免像Yeh這樣的患者受到傷害。受他最近一次幸免于難的啟發(fā)，他一直致力于建立更好的藥物測試模型：“如果一個模型有足夠的正確部分，并且連接正確，那么我們將繼續(xù)改進其功能。”■
參考文獻
1. M. Hay et al., Nat. Biotech. 32, 40-51 (2014).
2. S. Kota et al., Oncogene 37, 4372-4384 (2018); doi: 10.1038/s41388-018-0257-5.
3. C. Delépine et al., Hum. Mol. Genetics. 25, 146-157 (2016); doi: 10.1093/hmg/ddv464.
（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術研究院的副研究員。）
作者Kendall Powell是常駐科羅拉多州拉法葉的自由科學作家。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2018年10月12日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2018/10/replacing-replacements-animal-model-alternatives。