推陳出新：染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的新發(fā)展

   染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，它已經(jīng)有30多年的歷史，有些技術(shù)已經(jīng)發(fā)生了變化，而有些則保持不變。

   ChIP的基本操作方案仍與上世紀(jì)80年代開發(fā)的方案類似，涉及用甲醛將蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，然后對DNA進(jìn)行剪切。對于與DNA相互作用的蛋白質(zhì)使用抗體進(jìn)行免疫沉淀，加熱解除交聯(lián)，并分析捕獲的DNA。研究人員后來將這項技術(shù)與深度測序聯(lián)系起來，開發(fā)出ChIP-seq技術(shù)，在基因組層面探索蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。

   ChIP被廣泛地用于研究轉(zhuǎn)錄因子工作原理、組蛋白對基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理以及其它與生物發(fā)育和疾病相關(guān)的基本問題。2018年9月，C. David Allis和Michael Grunstein因基于ChIP的組蛋白研究成果獲得著名的拉斯克獎。ChIP-seq現(xiàn)在是ENCODE（DNA元件百科全書）項目的基石，該項目旨在繪制各種細(xì)胞類型中基因組的調(diào)控區(qū)域。

   染色質(zhì)研究者們也在開發(fā)一種點陣技術(shù)，以超越或者拓展已有的ChIP和ChIP-seq技術(shù)，用來檢測蛋白質(zhì)復(fù)合物，更準(zhǔn)確地鑒定某個蛋白因子結(jié)合的具體核苷酸，研究小量的細(xì)胞樣品，甚至開始在單細(xì)胞水平初步探索蛋白質(zhì)-DNA的相互作用。

   所有這些技術(shù)都旨在完成ChIP-seq單獨無法完成或只能緩慢完成的任務(wù)。它們都有一個共同的基本目標(biāo)：找出與DNA相關(guān)的分子以及它們的位置。

   位于馬薩諸塞州坎布里奇市的Broad研究所表觀基因組學(xué)項目主任Bradley Bernstein表示：“我們真的不了解基因組中調(diào)控功能序列決定基因何時何地表達(dá)的基本原理。”他補(bǔ)充說，ChIP “在很多方面都有局限性。因此，人們努力嘗試和發(fā)明新方法或以新方式改良技術(shù)”。

 

為經(jīng)典技術(shù)賦能

 

   “把ChIP-seq稱為黑魔法有點太過分。”以色列耶路撒冷希伯來大學(xué)計算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)教授Nir Friedman表示。但盡管這是一種常用的技術(shù)，“很少有人有足夠的耐心來校準(zhǔn)他們的實驗”。

   Friedman指出，ChIP-seq實驗會產(chǎn)生很多噪音。甲醛可以使未參與反應(yīng)的分子交聯(lián)，抗體可以捕獲非靶蛋白，而超聲波作為最常見的分解DNA的方法，更傾向于分解處于開放構(gòu)象的DNA。他說：“有可能超過一半的測序或觀察的結(jié)果是非特異性結(jié)合的。”

   Friedman介紹，ENCODE發(fā)布了評估抗體質(zhì)量和篩選無意義數(shù)據(jù)的指導(dǎo)方針。該項目還提供了對最新計算工具的訪問地址，例如，將實驗組與對照組數(shù)據(jù)歸一化的方法和識別可能的DNA結(jié)合的“峰值”或區(qū)域的方法。

   特別是，選擇正確的抗體是一項挑戰(zhàn)，北卡羅來納州達(dá)勒姆研究三角公園的表觀遺傳學(xué)公司EpiCypher首席科學(xué)官Michael-Christopher Keogh指出。Keogh參與了最近的一項研究，該研究表明，許多在組蛋白研究中被廣泛使用的抗體在ChIP中表現(xiàn)不佳，例如與非靶標(biāo)蛋白的表位結(jié)合。該研究還提出了ENCODE準(zhǔn)則之外的驗證步驟。

   一些研究人員通過在他們的目標(biāo)上設(shè)計一個抗原決定簇標(biāo)簽來繞過抗體問題，比如CETCh-seq（CRISPR抗原決定簇標(biāo)簽ChIP-seq）。一個長期存在的技術(shù)——DamID（DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶鑒定）是利用工程化的蛋白因子和標(biāo)簽分子來標(biāo)記相鄰的DNA。

   還有一些研究人員仍在改進(jìn)基本的ChIP技術(shù)，比如加州大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)部的Alon Goren團(tuán)隊，他們已經(jīng)開發(fā)出了自動化的ChIP-seq。Goren說，抗體和細(xì)胞類型之間的最佳抗體濃度可能有很大差異，某些步驟（如解交聯(lián)）是不必要的。Goren實驗室還表明單克隆抗體優(yōu)于多克隆抗體。

   但是，即使在完全優(yōu)化之后，ChIP-seq從根本上仍然是有局限性的。Goren說，例如通常需要10萬個或更多的細(xì)胞來研究轉(zhuǎn)錄因子，需要1萬個或更多的細(xì)胞來研究組蛋白。在大多數(shù)情況下，這種方法每次只針對一種蛋白質(zhì)、一種抗體。

   Goren說：“一旦我們能夠?qū)⑺伎嫉膶ο髲牡鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)向復(fù)合物，我們就能更好地理解生物是如何工作的以及在疾病中會發(fā)生什么。”

 

給蛋白質(zhì)復(fù)合物加一個把手

 

   研究復(fù)合物的一種方法是將ChIP-seq與質(zhì)譜（MS）相結(jié)合，使用RIME（內(nèi)源性蛋白質(zhì)的快速免疫沉淀質(zhì)譜）和ChIP-MS等方法。

   然而，費城賓夕法尼亞大學(xué)的分子生物學(xué)專家David Steger說，這些方法的一個缺點是，與DNA無關(guān)的蛋白質(zhì)也可以通過免疫沉淀被拉下來。“每個人都在努力開發(fā)針對特定增強(qiáng)子的位點特異性蛋白質(zhì)組學(xué)。”

   鑒定染色質(zhì)結(jié)合復(fù)合物的一種新興技術(shù)是ChIP-SICAP（選擇性分離染色質(zhì)相關(guān)蛋白），其由德國海德堡德國癌癥研究中心的Jeroen Krijgsveld和他的同事開發(fā)。這項技術(shù)包括用生物素標(biāo)記抗體結(jié)合的DNA，然后用鏈霉親和素珠子將生物素化的分子進(jìn)行捕獲，隨后利用質(zhì)譜進(jìn)行分析。

   Steger正在應(yīng)用ChIP-SICAP檢測與促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的增強(qiáng)子結(jié)合的蛋白質(zhì)。Steger說：“我們正在嘗試鑒定一個增強(qiáng)子蛋白質(zhì)組。”

   有些方法還利用Cas9的基因編輯系統(tǒng)，其中包括能識別特定DNA序列的向?qū)NA。研究人員已經(jīng)用生物素或一種酶標(biāo)記了Cas9，這種酶可以促進(jìn)附近蛋白質(zhì)的生物素標(biāo)記，MS.分析了這些蛋白質(zhì)。這樣的方法可能會擴(kuò)展ChIP-seq相關(guān)的方法，評估基因組的三維結(jié)構(gòu)，如Hi-C、ChIA-PET（通過配對末端標(biāo)記測序進(jìn)行染色質(zhì)相互作用分析）和HiChIP以及更新型的方法，如SPRITE（通過標(biāo)記擴(kuò)展進(jìn)行相互作用的分類識別）。

   這些檢測DNA結(jié)合復(fù)合體的新方法有望使生物學(xué)研究人員對基因調(diào)控的認(rèn)識更加清晰。但是當(dāng)它們被用于質(zhì)譜分析時，它們面臨的限制是不容易檢測到低豐度蛋白質(zhì)，Steger說。此外，并非所有較新的技術(shù)都適合非專業(yè)人士使用。

   有幾家公司提供RIME或ChIP-seq等相對成熟技術(shù)的外包服務(wù)。提供ChIP-seq和相關(guān)服務(wù)的公司包括加利福尼亞州卡爾斯巴德的Active Motif公司、位于比利時列日和新澤西州登維爾的Diagenode以及北京的Novogene。這些公司和其他公司也提供ChIP-seq試劑盒和試劑耗材，不過很多實驗室都有自己的試劑。Keogh還指出，內(nèi)部研究可能意味著對優(yōu)化步驟的更好控制。

   Cigall Kadoch的團(tuán)隊在Dana-Farber癌癥研究所和馬薩諸塞州波士頓的哈佛醫(yī)學(xué)院研究一些大型的蛋白質(zhì)復(fù)合物。他說，在ChIP實驗過程中對實驗參數(shù)的關(guān)注可以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

   Kadoch仔細(xì)優(yōu)化甲醛的濃度，在應(yīng)用不同抗體和細(xì)胞類型時，甲醛的作用是將各種蛋白質(zhì)與DNA相互交聯(lián)。當(dāng)選擇抗體時，她提醒研究人員應(yīng)該預(yù)測抗原決定簇是否會出現(xiàn)在蛋白表面，從而可以實現(xiàn)免疫沉淀。為了了解一個完全組裝好的復(fù)合物的DNA足跡，她建議選擇一種在組裝過程后期加上的蛋白質(zhì)的抗體。“這些是決定項目成敗的因素。” 

 

關(guān)注蛋白因子的結(jié)合

 

   Steger使用的另一種技術(shù)是ChIP-exo（ChIP外切酶）。他將其應(yīng)用于各種蛋白因子結(jié)合在基因組上結(jié)合位置的鑒定，以達(dá)到堿基對水平的分辨率。

   這項技術(shù)開始于DNA的超聲破碎。外切酶將DNA（以5' -3 '方向）剪切到DNA通過甲醛與結(jié)合蛋白連接的邊緣。這種方法為結(jié)合因子提供了一個清晰的DNA“足跡”，它比使用ChIP-seq計算生成的推斷序列更精確。

   “我們總是從ChIP-seq開始，隨著問題的發(fā)展轉(zhuǎn)向ChIP-exo。”Steger說，他使用這項技術(shù)來評估糖皮質(zhì)激素受體與DNA的結(jié)合，受體作為二聚體與相鄰的兩個短DNA序列結(jié)合。Steger能夠解決一個單體的結(jié)合，這是用ChIP-seq無法做到的。

   賓夕法尼亞州立大學(xué)帕克分校生物化學(xué)和分子生物學(xué)教授Frank Pugh的團(tuán)隊最近簡化了ChIP-exo方法，并將其應(yīng)用于常用的Illumina測序平臺。同樣，密蘇里州堪薩斯城斯托爾斯醫(yī)學(xué)研究所副研究員Julia Zeitlinger和同事發(fā)表了一項相關(guān)技術(shù)ChIP-nexus。這兩項進(jìn)展都“很有希望”，加州斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)系主任、基因組學(xué)和個性化醫(yī)學(xué)中心主任Michael Snyder表示。

 

測得更小也更深

 

   Friedman說，通過調(diào)整實驗參數(shù)，例如使用高質(zhì)量的抗體，研究人員已經(jīng)能夠減少ChIP-seq所需的細(xì)胞數(shù)量。某些技術(shù)包括Friedman開發(fā)的一種使用條形碼測序適配器的技術(shù)，使樣本量減少。而一項名為“ChIPmentation”的新技術(shù)則減化了構(gòu)建測序文庫的程序。

   一種進(jìn)入實驗室的新方法是CUT&RUN（目標(biāo)引導(dǎo)并利用核酸酶的切割和釋放），由華盛頓西雅圖Fred Hutchinson癌癥研究中心的Steve Henikoff和他的同事開發(fā)。該方法不需要甲醛交聯(lián)，也不需要超聲剪切DNA。相反，一種針對靶標(biāo)蛋白的抗體與微球菌核酸酶（MNase）結(jié)合，后者能夠被鈣激活而切割靶標(biāo)兩邊的DNA。接著，產(chǎn)生的DNA片段被測序。

   位于西雅圖的Altius生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所所長John Stamatoyannopoulos說，與ChIP-seq相比，“它可以大大減少噪音，而得到有效信號”。這在一定程度上是因為核酸酶對DNA的干凈切割，而非位點特異性切割的水平較低。因此，CUT&RUN所需的DNA測序讀取量通常比ChIP-seq要少，從而獲得低成本，而且適用于細(xì)胞數(shù)量少得多的情況。Henikoff的團(tuán)隊最近將這項技術(shù)應(yīng)用于在1000個細(xì)胞中研究一種轉(zhuǎn)錄因子，以及應(yīng)用于100個細(xì)胞檢測一種組蛋白修飾。Stamatoyannopoulos說，在他的實驗室里，這種方法已經(jīng)在很大程度上取代了ChIP-seq。

   CUT&RUN還具有比處理微量樣本更大的優(yōu)勢。分子生物學(xué)專家、哈佛大學(xué)教授Stuart Orkin稱贊這種技術(shù)具有“實質(zhì)上的單核苷水平”的分辨率。通過對計算工具的微小調(diào)整，他的團(tuán)隊能夠區(qū)分出控制胎兒血紅蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的緊密結(jié)合位點。在獲得這一結(jié)果之前，他無法用常規(guī)ChIP免疫沉淀該轉(zhuǎn)錄因子，這可能是因為甲醛交聯(lián)隱藏了表位。他說，一換成CUT&RUN“馬上就成功了”。

   Henikoff的實驗室已經(jīng)采用了這項技術(shù)來評估DNA的長期三維相互作用，并使用第二抗體對分離出的片段進(jìn)行免疫沉淀。該小組研究了同一蛋白質(zhì)復(fù)合體上的兩個分子特征，這種方法對于研究諸如“哪些組蛋白標(biāo)記的組合會影響不同的基因狀態(tài)”之類的問題可能很有幫助。

 

單細(xì)胞水平的工作

 

   對于許多分子生物學(xué)研究人員包括染色質(zhì)研究者來說，單細(xì)胞是最后的要塞。

   Bernstein說：“我們需要用精準(zhǔn)的、確定性的方法直接評估單個細(xì)胞中單分子間的相互作用。這是一個長期目標(biāo)。”當(dāng)細(xì)胞在發(fā)育過程中或在細(xì)胞高度異質(zhì)性的腫瘤中退出干細(xì)胞狀態(tài)時，單細(xì)胞數(shù)據(jù)可能有助于跟蹤DNA結(jié)合因子。

   有幾種方法正在接近這一目標(biāo)。然而，“許多單細(xì)胞方法的靈敏度仍然有限。”加州大學(xué)圣地亞哥分�；蚪M生物學(xué)專家Christopher Benner說。例如，Bernstein和他的同事使用微流控系統(tǒng)和條形碼技術(shù)采集單細(xì)胞ChIP-seq數(shù)據(jù)。該技術(shù)從每個細(xì)胞中捕獲到500~10000個獨特的代表DNA結(jié)合事件的“可讀取片段”，而在細(xì)胞群中則可以捕獲到數(shù)百萬個可讀取片段。

   有幾種方法也可以產(chǎn)生基因組活躍區(qū)域的數(shù)據(jù)。ATAC-seq（基于測序的轉(zhuǎn)座酶可達(dá)染色質(zhì)測定）在開放染色質(zhì)區(qū)域部署一個整合到基因組的超高活性轉(zhuǎn)座酶，并引入測序適配器。ATAC-seq可適用于單個細(xì)胞，而且得到的序列數(shù)據(jù)可以用各種計算方法進(jìn)行分析。例如，這些方法可以鑒定啟動子序列，或者識別實驗中的條件同時敲除DNA控制元件，又或者評估RNA表達(dá)。

   Snyder指出，ATAC-seq存在一些缺陷，例如未完全整合到可達(dá)區(qū)域。但是這項技術(shù)仍然很強(qiáng)大，它可以被用于插入熒光團(tuán)并進(jìn)行成像，從而在測序之前得到3D基因組結(jié)構(gòu)的成像數(shù)據(jù)。

   Snyder表示，在斯坦福大學(xué)的Alistair Boettiger等實驗室里，成像工作正在進(jìn)行，他們正在開發(fā)利用超分辨率成像技術(shù)同時成像基因元件和新生RNA轉(zhuǎn)錄本的方法，以評估哪些元件促進(jìn)或抑制了基因表達(dá)。“成像是未來的趨勢。”Stamatoyannopoulos補(bǔ)充道。其他研究人員注意到，隨著“三代”納米孔測序技術(shù)的改進(jìn)，將會開發(fā)出類似ChIP的方法來插入它。

   “我們可能需要完全正交的方法來達(dá)到這個目標(biāo)。”研究單細(xì)胞染色質(zhì)分析的Bernstein說，基于“某些與我們現(xiàn)在使用的完全不同的技術(shù)”，這個目標(biāo)最終很可能會成功實現(xiàn)�！�

（譯者李楠系中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員）

作者Charlotte Schubert是一位常駐西雅圖的自由記者。2015~2016年，她曾經(jīng)在Steve Henikoff的實驗室里參與一些與本文所涉及內(nèi)容無關(guān)的項目研究工作。

鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會（www.aaas.org）發(fā)布在2018年12月16日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2018/12/chip-old-block-beyond-chromatin-immunoprecipitation。