“基因組編輯”是如何如此迅速地成為家喻戶曉的詞匯的？投資公司Versant Ventures的Jerel Davis是在華盛頓西雅圖舉行的2019年生命科學創(chuàng)新西北（LSINW）大會上開啟的一個基因編輯小組里提出了這個問題。“基因組編輯是兩項發(fā)現(xiàn)的并列，”來自基因和細胞治療公司Bluebird Bio的小組成員Philip Gregory解釋道：核酸酶可以在特定序列上造成雙鏈DNA斷裂（DSBs），而DSBs激活可以改變DNA的修復。
DSB修復有兩種機制。非同源末端連接（NHEJ）將末端連接在一起，通常在此過程中產(chǎn)生插入和刪除(indels)。在基因組編輯中，這可以用于敲除基因功能。同源介導修復（HDR）使用序列相似的DNA修復DSB。為細胞提供外部同源供體DNA可通過HDR進行編輯。
許多基因組編輯系統(tǒng)通過使用工程化鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）或歸巢核酸內切酶在特定位點激活DSB修復來發(fā)揮作用(1)。目前，主要的基因組編輯方法是CRISPR-Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列相關蛋白9）(2)。研究人員如何在這些系統(tǒng)中進行選擇？
“主要考慮的是最終產(chǎn)品，”位于波特蘭的俄勒岡健康與科學大學的Jon Hennebold表示。Hennebold領導著一個由美國國立衛(wèi)生研究院資助的關于基因組編輯效率和安全性的多站點項目。公司使用專為特異性而優(yōu)化的專有基因組編輯系統(tǒng)，以減少脫靶效應（意外位點的突變）。大多數(shù)學術實驗室都可以通過CRISPR獲得他們想要的產(chǎn)品，這既快捷又簡單。“你可以訂購組件，并在24到48小時內開始使用，”Hennebold說，“其他方法沒有這種商業(yè)支持。”
CRISPR：它能完成任務
“學術實驗室沒有理由使用其他方法，”位于北卡羅來納州達勒姆的杜克大學生物醫(yī)學工程師Charles Gersbach說。“對于普通的基因組編輯，Cas9和gRNA將完成這項工作。”Cas9是一種來自細菌抗病毒系統(tǒng)的酶，它在與引導RNA（gRNA）互補的DNA位點上產(chǎn)生DSB，并且在其附近還有一個前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）序列。編輯不需要CRISPR重復，所以Cas9加上一個gRNA可以通過NHEJ敲除基因。提供一個DNA片段可促進HDR介導的編輯。
西雅圖艾倫細胞科學研究所干細胞和基因編輯主任，也是LSINW小組成員的Ru Gunawardane指出，CRISPR在完成該研究所的使命——即了解細胞在正常、疾病和治療條件下是如何行動的方面一直是“游戲規(guī)則的改變者”。該研究所的研究人員在含有熒光蛋白的干細胞中使用CRISPR標記細胞器標記物，然后跟蹤這些融合蛋白及其在不同情況下的相互作用。目前，他們的工作包括將標記細胞分化為心肌細胞。
“到目前為止，我們已經(jīng)標記了40到50個位點，”Gunawardane說。“一旦你擁有CRISPR平臺，你只需要改變gRNA和在基因組中正確位置引入標簽的模板。”然而，在將這些細胞用于實驗或用于研究之前，研究所的研究人員會進行數(shù)月的下游質量控制，如實時成像和測序。
中國科學院植物生物學家高彩霞（音譯）表示，CRISPR在自己的研究領域也很常見。“所有方法在產(chǎn)生位點特異性突變方面都非常有效，”她說，“但CRISPR花費的時間最少，成本也最低。”
CRISPR替代品
不過，CRISPR介導的基因組編輯也有缺陷。PAM要求限制目標序列。Cas9體積很大，因此其基因很難通過基因治療中常用的腺相關病毒等載體傳遞到細胞中�？茖W家們擔心脫靶效應，盡管專家指出，對意外突變的擔憂往往是基于改進編輯研究的計算。這些研究可能故意使用低特異性條件來促進監(jiān)測進展。
為了確保對其產(chǎn)品的最高信心，公司在專注于效率和特異性的定制基因組編輯方法上投入了時間和金錢。行業(yè)科學家表示，初期投資可以通過防止開發(fā)后期出現(xiàn)問題來獲得回報。
ZFNs是位于加州布里斯班的基因組醫(yī)學公司Sangamo使用的基因組編輯試劑。首席技術官Ed Rebar解釋稱，Sangamo公司的核心編輯試劑是ZFN二聚體。典型的目標位點是36個堿基對。每個ZFN都是來自FokI限制性內切酶的核酸酶結構域的嵌合蛋白以及一系列鋅指DNA結構域，這些結構域是由Sangamo公司數(shù)千個雙指亞基檔案“混合和匹配”而構建的。使ZFN結構多樣化以實現(xiàn)高靶向能力的策略包括將FokI域附加到鋅指陣列的N-或C-末端，并在手指之間插入堿基跳躍連接子。借助Sangamo公司用于生成ZFN的高通量、自動化過程，Rebar表示，“從目標基因名稱開始，我們可以在兩周內生成一套初始編輯試劑。”
在一項展示研究中，Rebar和同事設計的ZFNs，在與研究血紅蛋白病相關的啟動子中的28個堿基中的25個堿基插入缺失突變(3)。盡管具有這種精度和比Cas9小的優(yōu)勢，但ZFNs并不像基于CRISPR的方法那樣普遍使用。Sangamo公司通過產(chǎn)業(yè)界和學術界的合作關系提供ZFNs，但擁有制造它們的模塊、專業(yè)知識和專利。
TALENs將FokI連接到最初來自植物病原體的DNA結合模塊陣列上，每個模塊都靶向一個堿基對。TALENs比Cas9小，但比ZFNs大。這些模塊具有較高的DNA結合親和力，但也包含了會給克隆帶來挑戰(zhàn)的重復序列。
Dan Carlson是Recombinetics的首席科學官。Recombinetics是一家總部位于明尼蘇達州圣保羅的生物技術公司，該公司利用TALENs和CRISPR技術為臨床研究模型和農業(yè)生成動物和細胞系。他說，使用這些方法，“我們幾乎可以瞄準基因組中的任何位點。”Carlson補充道，憑借內部資源，即使是TALENs也只需要“幾百美元和大約一周”即可生成，所以科學家們會根據(jù)試點研究選擇最具重復性、一致性和針對性的方法。他指出，這些初始投資確保公司對資源負責。“在后端解決問題的成本太高了。”
Meganucleases，即歸巢核酸內切酶，盡管它的名字指的是長度可達40個堿基對的識別序列，但它比Cas9要小。單鏈融合酶megaTALs將TALENS的簡單組裝和歸巢內切酶的DNA切割特異性結合起來。位于馬薩諸塞州劍橋的Bluebird Bio和位于北卡羅來納州達勒姆的Precision BioSciences是兩家使用基于歸巢核酸內切酶方法的生物技術公司。
位于西雅圖的福瑞德·哈金森癌癥研究中心結構生物學家Barry Stoddard擁有一組50~60種歸巢核酸內切酶，他的實驗室工程師可以用來識別特定的序列。“制造CRISPR以靶向基因需要一天的時間，”他說，“而制造一個歸巢核酸內切酶則需要100天。”盡管如此，Stoddard還是收到了很多工程化歸巢核酸內切酶的請求，因為它們的精確度在諸如開發(fā)“100天不算什么”的療法等應用中具有很高的價值。
是否需要DSB
依靠HDR進行編輯可能會導致插入缺失或染色體易位。Stoddard觀察到，即便是精確定位的核酸酶，使用HDR“你也會受到細胞的支配。”他補充道，要想在沒有HDR不可預測性的情況下進行編輯，需要關注特異位點重組酶（SSRs）的發(fā)展。
“SSRs可以做所有的事情，”蘇格蘭格拉斯哥大學分子遺傳學家Marshall Stark表示。“它們在不需要宿主因素的情況下斷開并重新連接DNA。”即使在低HDR或沒有HDR的細胞中，SSRs也可以在目標位點整合外源DNA。Stark說，在最佳條件下，“SSRs可以非常高效，在幾分鐘內重組接近100%。”SSRs可以進行類似開關的改變，比如逆轉DNA片段的方向。這使得它們在為工業(yè)目的或合成生物學應用創(chuàng)建出控制細胞行為的類似電子電路的路徑方面很有價值，如制造生物計算機。然而，SSRs具有復雜、罕見、30~50個堿基對的靶位點。
Stark提出了兩種使SSRs適應更廣泛的基因組編輯的方法：（1）利用定向進化來選擇新的特異性靶標；（2）制造融合蛋白。例如，他和其他人正在將SSR衍生的重組酶結構域連接到結合特定DNA序列的鋅指模塊上。這項技術“仍處于調查階段，”Stark指出。“如果你心中有一個特定的目標，那么為它制造重組酶仍有很多工作要做。”
對于沒有DSBs的基因組編輯，研究人員使用仍然由gRNA控制，但不切割DNA或只產(chǎn)生單鏈切口的Cas9。Cas9變體與轉錄激活因子或抑制因子融合，或者與酶融合，通過修飾DNA或DNA包裝組蛋白來改變基因表達，從而改變染色質結構。這種表觀基因組編輯類似于自然基因調控，Gersbach說，“沒有DNA序列脫靶改變的風險。”該方法是研究表觀遺傳學的基礎研究工具，具有潛在的治療用途，例如重新激活導致智力殘疾的脆性X染色體綜合征的沉默基因(4)。
堿基編輯使單堿基對改變，同時避免了DSB修復中的意外突變。它適用于沒有HDR的細胞。這種方法的創(chuàng)新定期發(fā)表，但哈佛大學的David Liu小組開發(fā)的第一個堿基編輯器有一個靶向DNA序列的失活Cas9與一種能將胞嘧啶轉化為尿嘧啶的酶融合。融合蛋白將胞嘧啶—鳥嘌呤變成胸腺嘧啶—腺嘌呤。另一個堿基編輯器是Liu的實驗室通過蛋白質工程和定向進化產(chǎn)生的，它將腺嘌呤—胸腺嘧啶改變?yōu)轼B嘌呤—胞嘧啶。Liu斷言，僅僅這兩種堿基編輯系統(tǒng)就能改變三分之一的堿基對，并有可能糾正62%的已知人類致病點突變。
Liu指出，截至2019年夏天，已有100多篇研究論文描述了使用堿基編輯的實驗，“其中有幾篇是通過直接逆轉點突變來糾正人類遺傳疾病的動物模型的實驗。”例如，一個編輯器糾正了導致苯丙酮尿癥的突變(5)。Liu和其他人正在使堿基編輯多樣化——擴大堿基改變選項，增加特異性，并提高活體動物和需要區(qū)分高度相似序列的靶點的活性。
基因編輯的未來
作為一名使用基因組編輯技術的科學家，Carlson希望研究人員將其應用于造福人類和地球。他希望公眾明白，獲得最終產(chǎn)品實際上是一個漫長的過程。生物技術公司Recombinetics因為使用TALENs來繁殖無角牛（這省去了農民去角的麻煩）而受到媒體的關注。該項目始于2012年，Carlson表示，公司將繼續(xù)致力于提高編輯效率。
鑒于CRISPR的普及和可用性，它在基因組編輯預測中占據(jù)主導地位。Carlson表示，基于CRISPR的系統(tǒng)將繼續(xù)不斷改進。研究人員定期發(fā)表具有更高效率或特異性的改良gRNAs。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或改造了多種具有不同PAMs或活性的Cas型酶 (6)。例如，Cas13靶向RNA，是RNA堿基編輯的基礎。這種方法和Liu的DNA堿基編輯技術被Beam Therapeutics公司授權使用，該公司的聯(lián)合創(chuàng)始人包括Liu和張鋒（音譯），他們開發(fā)了哺乳動物細胞的CRISPR。
CRISPR方法上的改進包括在編輯過程中用小分子處理細胞，將DSB修復從NHEJ向HDR方向推進�？煽叵到y(tǒng)使用光或小分子打開Cas9，限制其活性，以減少脫靶效應。研究人員正在微生物界中搜尋新的Cas型酶和全新的基因組編輯系統(tǒng)。“我們仍在識別具有編輯能力的新分子，我們還沒有完全了解我們擁有的編輯工具，”Hennebold說道。“我們還有很多東西要學。”
使用CRISPR糾正致病突變的實踐正在增長：Editas Medicine和Allergan宣布了針對遺傳性失明的人體CRISPR治療試驗。治療性CRISPR的一個潛在障礙是人類可能對其細菌成分產(chǎn)生免疫反應。例如，大多數(shù)被檢測的血液樣本顯示存在對Cas9的免疫反應，而Cas9通常取自葡萄球菌或鏈球菌(7)。
基因組編輯的愿望清單包括更好的多路復用方法——一次編輯多個基因。例如，多路復用將加快基于T細胞的免疫療法的發(fā)展，這種療法適用于許多患者，但需要改變多個基因。植物科學家們經(jīng)常想要創(chuàng)造連鎖基因的“堆疊”，這些基因可以一起遺傳，以抵御疾病、害蟲和其他農業(yè)威脅。多路復用將加速這些產(chǎn)品的創(chuàng)建。
原則上，CRISPR的多路復用很簡單，只需要為每個靶向基因引入單個Cas酶以及gRNA和模板DNA。Gunawardane曾嘗試使用CRISPR多路復用技術來標記同一細胞中的多個基因，并表示這是可以實現(xiàn)的，但在實踐中，隨著每個添加基因的增加，情況會變得越來越復雜。使用SSRs、ZFNs或歸巢核酸內切酶的系統(tǒng)可能具有一些優(yōu)勢，比如更小的組件更容易被導入。
當向科學家詢問有關基因組編輯的挑戰(zhàn)時，他們會提到將組件遞送入細胞。他們說，要注意將編輯酶作為蛋白質而不是基因傳遞的瞬時系統(tǒng)，這樣，蛋白質在作用后就會降解，而不是持續(xù)表達。以這種方式限制活動可以減少脫靶效應。高彩霞（音譯）指出，基因組編輯系統(tǒng)的DNA獨立遞送可以緩解對轉基因生物的擔憂。“蛋白質不能整合到基因組中，”她說，“因此，如果根本沒有外源DNA被遞送，那么由此產(chǎn)生的植物應該被視為非轉基因植物。”
高彩霞（音譯）指出，CRISPR已經(jīng)非常強大，所以很多人都在研究它和其他基因組編輯系統(tǒng)，它們將不可避免地繼續(xù)改進。“科學家們喜歡制造新工具和新技術，”她說，“所以我們真的每天都能看到進步�，F(xiàn)在，我們說原則上我們可以編輯任何目標，但五年后這將成為現(xiàn)實。”■
參考文獻
1. A. J. Bogdanove, et al., Nucleic Acids Res. 46, 4845-4871 (2018), doi: 10.1093/nar/gky289.
2. A. C. Komor, A. H. Badran, D. R. Liu, Cell 168, 20-36 (2017), doi: 10.1016/j.cell.2016.10.044.
3. D. E. Paschon et al., Nat. Comm. 10, 1133 (2019), doi: 10.1038/s41467-019-08867-x.
4. X. S. Liu et al., Cell 172, 979-992 (2018), doi: 10.1016/j.cell.2018.01.012.
5. L. Villiger et al., Nat. Med. 24, 1519-1525 (2018), doi: 10.1038/s41591-018-0209-1.
6. A. Pickar-Oliver, C. A. Gersbach, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 490-507 (2019), doi: 10.1038/s41580-019-0131-5.
7. C. T. Charlesworth et al., Nat. Med. 25, 249-254 (2019), doi: 10.1038/s41591-018-0326-x.
Chris Tachibana是美國西雅圖和丹麥哥本哈根的科學作家。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2019年9月27日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2019/09/beyond-crispr-what-s-current-and-upcoming-genome-editing。