“基因組編輯”是如何如此迅速地成為家喻戶(hù)曉的詞匯的？投資公司Versant Ventures的Jerel Davis是在華盛頓西雅圖舉行的2019年生命科學(xué)創(chuàng)新西北（LSINW）大會(huì)上開(kāi)啟的一個(gè)基因編輯小組里提出了這個(gè)問(wèn)題。“基因組編輯是兩項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的并列，”來(lái)自基因和細(xì)胞治療公司Bluebird Bio的小組成員Philip Gregory解釋道：核酸酶可以在特定序列上造成雙鏈DNA斷裂（DSBs），而DSBs激活可以改變DNA的修復(fù)。
DSB修復(fù)有兩種機(jī)制。非同源末端連接（NHEJ）將末端連接在一起，通常在此過(guò)程中產(chǎn)生插入和刪除(indels)。在基因組編輯中，這可以用于敲除基因功能。同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）使用序列相似的DNA修復(fù)DSB。為細(xì)胞提供外部同源供體DNA可通過(guò)HDR進(jìn)行編輯。
許多基因組編輯系統(tǒng)通過(guò)使用工程化鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）或歸巢核酸內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)激活DSB修復(fù)來(lái)發(fā)揮作用(1)。目前，主要的基因組編輯方法是CRISPR-Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白9）(2)。研究人員如何在這些系統(tǒng)中進(jìn)行選擇？
“主要考慮的是最終產(chǎn)品，”位于波特蘭的俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)的Jon Hennebold表示。Hennebold領(lǐng)導(dǎo)著一個(gè)由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院資助的關(guān)于基因組編輯效率和安全性的多站點(diǎn)項(xiàng)目。公司使用專(zhuān)為特異性而優(yōu)化的專(zhuān)有基因組編輯系統(tǒng)，以減少脫靶效應(yīng)（意外位點(diǎn)的突變）。大多數(shù)學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室都可以通過(guò)CRISPR獲得他們想要的產(chǎn)品，這既快捷又簡(jiǎn)單。“你可以訂購(gòu)組件，并在24到48小時(shí)內(nèi)開(kāi)始使用，”Hennebold說(shuō)，“其他方法沒(méi)有這種商業(yè)支持。”
CRISPR：它能完成任務(wù)
“學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有理由使用其他方法，”位于北卡羅來(lái)納州達(dá)勒姆的杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程師Charles Gersbach說(shuō)。“對(duì)于普通的基因組編輯，Cas9和gRNA將完成這項(xiàng)工作。”Cas9是一種來(lái)自細(xì)菌抗病毒系統(tǒng)的酶，它在與引導(dǎo)RNA（gRNA）互補(bǔ)的DNA位點(diǎn)上產(chǎn)生DSB，并且在其附近還有一個(gè)前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）序列。編輯不需要CRISPR重復(fù)，所以Cas9加上一個(gè)gRNA可以通過(guò)NHEJ敲除基因。提供一個(gè)DNA片段可促進(jìn)HDR介導(dǎo)的編輯。
西雅圖艾倫細(xì)胞科學(xué)研究所干細(xì)胞和基因編輯主任，也是LSINW小組成員的Ru Gunawardane指出，CRISPR在完成該研究所的使命——即了解細(xì)胞在正常、疾病和治療條件下是如何行動(dòng)的方面一直是“游戲規(guī)則的改變者”。該研究所的研究人員在含有熒光蛋白的干細(xì)胞中使用CRISPR標(biāo)記細(xì)胞器標(biāo)記物，然后跟蹤這些融合蛋白及其在不同情況下的相互作用。目前，他們的工作包括將標(biāo)記細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。
“到目前為止，我們已經(jīng)標(biāo)記了40到50個(gè)位點(diǎn)，”Gunawardane說(shuō)。“一旦你擁有CRISPR平臺(tái)，你只需要改變gRNA和在基因組中正確位置引入標(biāo)簽的模板。”然而，在將這些細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)或用于研究之前，研究所的研究人員會(huì)進(jìn)行數(shù)月的下游質(zhì)量控制，如實(shí)時(shí)成像和測(cè)序。
中國(guó)科學(xué)院植物生物學(xué)家高彩霞（音譯）表示，CRISPR在自己的研究領(lǐng)域也很常見(jiàn)。“所有方法在產(chǎn)生位點(diǎn)特異性突變方面都非常有效，”她說(shuō)，“但CRISPR花費(fèi)的時(shí)間最少，成本也最低。”
CRISPR替代品
不過(guò)，CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯也有缺陷。PAM要求限制目標(biāo)序列。Cas9體積很大，因此其基因很難通過(guò)基因治療中常用的腺相關(guān)病毒等載體傳遞到細(xì)胞中�？茖W(xué)家們擔(dān)心脫靶效應(yīng)，盡管專(zhuān)家指出，對(duì)意外突變的擔(dān)憂(yōu)往往是基于改進(jìn)編輯研究的計(jì)算。這些研究可能故意使用低特異性條件來(lái)促進(jìn)監(jiān)測(cè)進(jìn)展。
為了確保對(duì)其產(chǎn)品的最高信心，公司在專(zhuān)注于效率和特異性的定制基因組編輯方法上投入了時(shí)間和金錢(qián)。行業(yè)科學(xué)家表示，初期投資可以通過(guò)防止開(kāi)發(fā)后期出現(xiàn)問(wèn)題來(lái)獲得回報(bào)。
ZFNs是位于加州布里斯班的基因組醫(yī)學(xué)公司Sangamo使用的基因組編輯試劑。首席技術(shù)官Ed Rebar解釋稱(chēng)，Sangamo公司的核心編輯試劑是ZFN二聚體。典型的目標(biāo)位點(diǎn)是36個(gè)堿基對(duì)。每個(gè)ZFN都是來(lái)自FokI限制性?xún)?nèi)切酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白以及一系列鋅指DNA結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域是由Sangamo公司數(shù)千個(gè)雙指亞基檔案“混合和匹配”而構(gòu)建的。使ZFN結(jié)構(gòu)多樣化以實(shí)現(xiàn)高靶向能力的策略包括將FokI域附加到鋅指陣列的N-或C-末端，并在手指之間插入堿基跳躍連接子。借助Sangamo公司用于生成ZFN的高通量、自動(dòng)化過(guò)程，Rebar表示，“從目標(biāo)基因名稱(chēng)開(kāi)始，我們可以在兩周內(nèi)生成一套初始編輯試劑。”
在一項(xiàng)展示研究中，Rebar和同事設(shè)計(jì)的ZFNs，在與研究血紅蛋白病相關(guān)的啟動(dòng)子中的28個(gè)堿基中的25個(gè)堿基插入缺失突變(3)。盡管具有這種精度和比Cas9小的優(yōu)勢(shì)，但ZFNs并不像基于CRISPR的方法那樣普遍使用。Sangamo公司通過(guò)產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界的合作關(guān)系提供ZFNs，但擁有制造它們的模塊、專(zhuān)業(yè)知識(shí)和專(zhuān)利。
TALENs將FokI連接到最初來(lái)自植物病原體的DNA結(jié)合模塊陣列上，每個(gè)模塊都靶向一個(gè)堿基對(duì)。TALENs比Cas9小，但比ZFNs大。這些模塊具有較高的DNA結(jié)合親和力，但也包含了會(huì)給克隆帶來(lái)挑戰(zhàn)的重復(fù)序列。
Dan Carlson是Recombinetics的首席科學(xué)官。Recombinetics是一家總部位于明尼蘇達(dá)州圣保羅的生物技術(shù)公司，該公司利用TALENs和CRISPR技術(shù)為臨床研究模型和農(nóng)業(yè)生成動(dòng)物和細(xì)胞系。他說(shuō)，使用這些方法，“我們幾乎可以瞄準(zhǔn)基因組中的任何位點(diǎn)。”Carlson補(bǔ)充道，憑借內(nèi)部資源，即使是TALENs也只需要“幾百美元和大約一周”即可生成，所以科學(xué)家們會(huì)根據(jù)試點(diǎn)研究選擇最具重復(fù)性、一致性和針對(duì)性的方法。他指出，這些初始投資確保公司對(duì)資源負(fù)責(zé)。“在后端解決問(wèn)題的成本太高了。”
Meganucleases，即歸巢核酸內(nèi)切酶，盡管它的名字指的是長(zhǎng)度可達(dá)40個(gè)堿基對(duì)的識(shí)別序列，但它比Cas9要小。單鏈融合酶megaTALs將TALENS的簡(jiǎn)單組裝和歸巢內(nèi)切酶的DNA切割特異性結(jié)合起來(lái)。位于馬薩諸塞州劍橋的Bluebird Bio和位于北卡羅來(lái)納州達(dá)勒姆的Precision BioSciences是兩家使用基于歸巢核酸內(nèi)切酶方法的生物技術(shù)公司。
位于西雅圖的福瑞德·哈金森癌癥研究中心結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Barry Stoddard擁有一組50~60種歸巢核酸內(nèi)切酶，他的實(shí)驗(yàn)室工程師可以用來(lái)識(shí)別特定的序列。“制造CRISPR以靶向基因需要一天的時(shí)間，”他說(shuō)，“而制造一個(gè)歸巢核酸內(nèi)切酶則需要100天。”盡管如此，Stoddard還是收到了很多工程化歸巢核酸內(nèi)切酶的請(qǐng)求，因?yàn)樗鼈兊木_度在諸如開(kāi)發(fā)“100天不算什么”的療法等應(yīng)用中具有很高的價(jià)值。
是否需要DSB
依靠HDR進(jìn)行編輯可能會(huì)導(dǎo)致插入缺失或染色體易位。Stoddard觀(guān)察到，即便是精確定位的核酸酶，使用HDR“你也會(huì)受到細(xì)胞的支配。”他補(bǔ)充道，要想在沒(méi)有HDR不可預(yù)測(cè)性的情況下進(jìn)行編輯，需要關(guān)注特異位點(diǎn)重組酶（SSRs）的發(fā)展。
“SSRs可以做所有的事情，”蘇格蘭格拉斯哥大學(xué)分子遺傳學(xué)家Marshall Stark表示。“它們?cè)诓恍枰拗饕蛩氐那闆r下斷開(kāi)并重新連接DNA。”即使在低HDR或沒(méi)有HDR的細(xì)胞中，SSRs也可以在目標(biāo)位點(diǎn)整合外源DNA。Stark說(shuō)，在最佳條件下，“SSRs可以非常高效，在幾分鐘內(nèi)重組接近100%。”SSRs可以進(jìn)行類(lèi)似開(kāi)關(guān)的改變，比如逆轉(zhuǎn)DNA片段的方向。這使得它們?cè)跒楣I(yè)目的或合成生物學(xué)應(yīng)用創(chuàng)建出控制細(xì)胞行為的類(lèi)似電子電路的路徑方面很有價(jià)值，如制造生物計(jì)算機(jī)。然而，SSRs具有復(fù)雜、罕見(jiàn)、30~50個(gè)堿基對(duì)的靶位點(diǎn)。
Stark提出了兩種使SSRs適應(yīng)更廣泛的基因組編輯的方法：（1）利用定向進(jìn)化來(lái)選擇新的特異性靶標(biāo)；（2）制造融合蛋白。例如，他和其他人正在將SSR衍生的重組酶結(jié)構(gòu)域連接到結(jié)合特定DNA序列的鋅指模塊上。這項(xiàng)技術(shù)“仍處于調(diào)查階段，”Stark指出。“如果你心中有一個(gè)特定的目標(biāo)，那么為它制造重組酶仍有很多工作要做。”
對(duì)于沒(méi)有DSBs的基因組編輯，研究人員使用仍然由gRNA控制，但不切割DNA或只產(chǎn)生單鏈切口的Cas9。Cas9變體與轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子融合，或者與酶融合，通過(guò)修飾DNA或DNA包裝組蛋白來(lái)改變基因表達(dá)，從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。這種表觀(guān)基因組編輯類(lèi)似于自然基因調(diào)控，Gersbach說(shuō)，“沒(méi)有DNA序列脫靶改變的風(fēng)險(xiǎn)。”該方法是研究表觀(guān)遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究工具，具有潛在的治療用途，例如重新激活導(dǎo)致智力殘疾的脆性X染色體綜合征的沉默基因(4)。
堿基編輯使單堿基對(duì)改變，同時(shí)避免了DSB修復(fù)中的意外突變。它適用于沒(méi)有HDR的細(xì)胞。這種方法的創(chuàng)新定期發(fā)表，但哈佛大學(xué)的David Liu小組開(kāi)發(fā)的第一個(gè)堿基編輯器有一個(gè)靶向DNA序列的失活Cas9與一種能將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的酶融合。融合蛋白將胞嘧啶—鳥(niǎo)嘌呤變成胸腺嘧啶—腺嘌呤。另一個(gè)堿基編輯器是Liu的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)蛋白質(zhì)工程和定向進(jìn)化產(chǎn)生的，它將腺嘌呤—胸腺嘧啶改變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤—胞嘧啶。Liu斷言，僅僅這兩種堿基編輯系統(tǒng)就能改變?nèi)种坏膲A基對(duì)，并有可能糾正62%的已知人類(lèi)致病點(diǎn)突變。
Liu指出，截至2019年夏天，已有100多篇研究論文描述了使用堿基編輯的實(shí)驗(yàn)，“其中有幾篇是通過(guò)直接逆轉(zhuǎn)點(diǎn)突變來(lái)糾正人類(lèi)遺傳疾病的動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)。”例如，一個(gè)編輯器糾正了導(dǎo)致苯丙酮尿癥的突變(5)。Liu和其他人正在使堿基編輯多樣化——擴(kuò)大堿基改變選項(xiàng)，增加特異性，并提高活體動(dòng)物和需要區(qū)分高度相似序列的靶點(diǎn)的活性。
基因編輯的未來(lái)
作為一名使用基因組編輯技術(shù)的科學(xué)家，Carlson希望研究人員將其應(yīng)用于造福人類(lèi)和地球。他希望公眾明白，獲得最終產(chǎn)品實(shí)際上是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。生物技術(shù)公司Recombinetics因?yàn)槭褂肨ALENs來(lái)繁殖無(wú)角牛（這省去了農(nóng)民去角的麻煩）而受到媒體的關(guān)注。該項(xiàng)目始于2012年，Carlson表示，公司將繼續(xù)致力于提高編輯效率。
鑒于CRISPR的普及和可用性，它在基因組編輯預(yù)測(cè)中占據(jù)主導(dǎo)地位。Carlson表示，基于CRISPR的系統(tǒng)將繼續(xù)不斷改進(jìn)。研究人員定期發(fā)表具有更高效率或特異性的改良gRNAs。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或改造了多種具有不同PAMs或活性的Cas型酶 (6)。例如，Cas13靶向RNA，是RNA堿基編輯的基礎(chǔ)。這種方法和Liu的DNA堿基編輯技術(shù)被Beam Therapeutics公司授權(quán)使用，該公司的聯(lián)合創(chuàng)始人包括Liu和張鋒（音譯），他們開(kāi)發(fā)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的CRISPR。
CRISPR方法上的改進(jìn)包括在編輯過(guò)程中用小分子處理細(xì)胞，將DSB修復(fù)從NHEJ向HDR方向推進(jìn)�？煽叵到y(tǒng)使用光或小分子打開(kāi)Cas9，限制其活性，以減少脫靶效應(yīng)。研究人員正在微生物界中搜尋新的Cas型酶和全新的基因組編輯系統(tǒng)。“我們?nèi)栽谧R(shí)別具有編輯能力的新分子，我們還沒(méi)有完全了解我們擁有的編輯工具，”Hennebold說(shuō)道。“我們還有很多東西要學(xué)。”
使用CRISPR糾正致病突變的實(shí)踐正在增長(zhǎng)：Editas Medicine和Allergan宣布了針對(duì)遺傳性失明的人體CRISPR治療試驗(yàn)。治療性CRISPR的一個(gè)潛在障礙是人類(lèi)可能對(duì)其細(xì)菌成分產(chǎn)生免疫反應(yīng)。例如，大多數(shù)被檢測(cè)的血液樣本顯示存在對(duì)Cas9的免疫反應(yīng)，而Cas9通常取自葡萄球菌或鏈球菌(7)。
基因組編輯的愿望清單包括更好的多路復(fù)用方法——一次編輯多個(gè)基因。例如，多路復(fù)用將加快基于T細(xì)胞的免疫療法的發(fā)展，這種療法適用于許多患者，但需要改變多個(gè)基因。植物科學(xué)家們經(jīng)常想要?jiǎng)?chuàng)造連鎖基因的“堆疊”，這些基因可以一起遺傳，以抵御疾病、害蟲(chóng)和其他農(nóng)業(yè)威脅。多路復(fù)用將加速這些產(chǎn)品的創(chuàng)建。
原則上，CRISPR的多路復(fù)用很簡(jiǎn)單，只需要為每個(gè)靶向基因引入單個(gè)Cas酶以及gRNA和模板DNA。Gunawardane曾嘗試使用CRISPR多路復(fù)用技術(shù)來(lái)標(biāo)記同一細(xì)胞中的多個(gè)基因，并表示這是可以實(shí)現(xiàn)的，但在實(shí)踐中，隨著每個(gè)添加基因的增加，情況會(huì)變得越來(lái)越復(fù)雜。使用SSRs、ZFNs或歸巢核酸內(nèi)切酶的系統(tǒng)可能具有一些優(yōu)勢(shì)，比如更小的組件更容易被導(dǎo)入。
當(dāng)向科學(xué)家詢(xún)問(wèn)有關(guān)基因組編輯的挑戰(zhàn)時(shí)，他們會(huì)提到將組件遞送入細(xì)胞。他們說(shuō)，要注意將編輯酶作為蛋白質(zhì)而不是基因傳遞的瞬時(shí)系統(tǒng)，這樣，蛋白質(zhì)在作用后就會(huì)降解，而不是持續(xù)表達(dá)。以這種方式限制活動(dòng)可以減少脫靶效應(yīng)。高彩霞（音譯）指出，基因組編輯系統(tǒng)的DNA獨(dú)立遞送可以緩解對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的擔(dān)憂(yōu)。“蛋白質(zhì)不能整合到基因組中，”她說(shuō)，“因此，如果根本沒(méi)有外源DNA被遞送，那么由此產(chǎn)生的植物應(yīng)該被視為非轉(zhuǎn)基因植物。”
高彩霞（音譯）指出，CRISPR已經(jīng)非常強(qiáng)大，所以很多人都在研究它和其他基因組編輯系統(tǒng)，它們將不可避免地繼續(xù)改進(jìn)。“科學(xué)家們喜歡制造新工具和新技術(shù)，”她說(shuō)，“所以我們真的每天都能看到進(jìn)步�，F(xiàn)在，我們說(shuō)原則上我們可以編輯任何目標(biāo)，但五年后這將成為現(xiàn)實(shí)。”■
參考文獻(xiàn)
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5. L. Villiger et al., Nat. Med. 24, 1519-1525 (2018), doi: 10.1038/s41591-018-0209-1.
6. A. Pickar-Oliver, C. A. Gersbach, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 490-507 (2019), doi: 10.1038/s41580-019-0131-5.
7. C. T. Charlesworth et al., Nat. Med. 25, 249-254 (2019), doi: 10.1038/s41591-018-0326-x.
Chris Tachibana是美國(guó)西雅圖和丹麥哥本哈根的科學(xué)作家。
鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2019年9月27日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見(jiàn)https://www.sciencemag.org/features/2019/09/beyond-crispr-what-s-current-and-upcoming-genome-editing。