在21世紀(jì)之初，成本的急速下降和技術(shù)的飛速發(fā)展促使許多科學(xué)家爭(zhēng)先恐后地對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序�；蚪M學(xué)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展，眾多類型的生物完整的基因組序列都被公布于眾。雖然現(xiàn)在基因組測(cè)序已成為日常性的工作，但由此產(chǎn)生的大量DNA數(shù)據(jù)并不足以完全解釋生物學(xué)家研究的許多現(xiàn)象。

   一個(gè)同樣的基因組是如何產(chǎn)生復(fù)雜生物體中的所有細(xì)胞的？癌細(xì)胞通過(guò)開關(guān)哪些基因來(lái)逃避在其生長(zhǎng)過(guò)程中的正常檢查？淋巴細(xì)胞如何對(duì)病原體作出反應(yīng)，以及病原體如何逃避這種反應(yīng)？要回答這些問(wèn)題，需要通過(guò)測(cè)序和跟蹤基因組產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本的變化從而更深入地研究細(xì)胞信息流。

   但RNA比DNA更難研究：它很容易降解，必須逆轉(zhuǎn)錄來(lái)對(duì)接大多數(shù)測(cè)序技術(shù)。不同基因的轉(zhuǎn)錄本也有著巨大的差異。幸運(yùn)的是，研究人員和實(shí)驗(yàn)器材試劑供應(yīng)商一直在穩(wěn)步改進(jìn)RNA測(cè)序工具，為迅速發(fā)展的轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域提供動(dòng)力。隨著技術(shù)的進(jìn)步，科研人員們?cè)絹?lái)越多地研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的RNA變化，在全新水平上觀測(cè)了細(xì)胞行為。

 

原位的真實(shí)

 

   RNA測(cè)序的歷史是一個(gè)關(guān)于穩(wěn)步提高的分辨率的故事。十年前，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究人員從細(xì)胞群體中批量分離RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶和標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序技術(shù)來(lái)揭示每個(gè)群體的平均轉(zhuǎn)錄組。今天，這一領(lǐng)域已經(jīng)在很大程度上轉(zhuǎn)向單細(xì)胞RNA測(cè)序，使用各種技術(shù)來(lái)分離和標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞，然后為每個(gè)細(xì)胞生成單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄組圖譜。利用這種方法，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)在細(xì)胞間存在顯著差異，而這些群體在之前還被認(rèn)為是具有同質(zhì)性的。

   2014年，位于哈佛大學(xué)的維斯研究所的研究人員更進(jìn)一步，對(duì)細(xì)胞中的RNA進(jìn)行了原位測(cè)序，以準(zhǔn)確顯示哪些細(xì)胞在完整的組織切片和培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)錄了哪些基因。這項(xiàng)技術(shù)需要將細(xì)胞的RNA固定在適當(dāng)?shù)奈恢�，然后直接在固定的樣本上�?zhí)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測(cè)序步驟。由于測(cè)序過(guò)程使用了四個(gè)堿基的熒光標(biāo)記，研究人員可以在熒光顯微鏡下拍攝每一步，用計(jì)算機(jī)處理圖像，并繪制出每個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)的RNA序列。

    “它做的是市面上很多新一代測(cè)序儀做的事情；但它不是在流體腔里做，而是在樣品自身內(nèi)部做”。 維斯研究所合成生物學(xué)平臺(tái)的首席高級(jí)研究員Richie Kohman說(shuō)。

   Kohman和他的同事們現(xiàn)在正在眾多項(xiàng)目中使用這項(xiàng)名為“熒光原位測(cè)序”(FISSEQ)的技術(shù)。在一項(xiàng)工作中，研究小組使用基因工程病毒為單個(gè)小鼠神經(jīng)元分配獨(dú)特的標(biāo)簽，然后執(zhí)行FISSEQ來(lái)檢測(cè)病毒RNA并繪制動(dòng)物神經(jīng)元連接的圖譜。另一個(gè)項(xiàng)目使用基因編輯載體來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞RNA標(biāo)簽，隨著老鼠從胚胎發(fā)育到成年，這種標(biāo)簽會(huì)隨著時(shí)間的推移而變化。在這些小鼠身上進(jìn)行FISSEQ應(yīng)該可以讓研究人員追蹤每一個(gè)細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的聯(lián)系。

    “盡管FISSEQ比在分離的細(xì)胞中測(cè)序RNA明顯產(chǎn)生更深層次的數(shù)據(jù)，但FISSEQ更難掌握。你必須將RNA轉(zhuǎn)換成DNA，然后你必須讓DNA形成一個(gè)環(huán)，然后你才能進(jìn)行擴(kuò)增；所以做這件事所需的所有化學(xué)過(guò)程需要大量的工作”。Kohman說(shuō)。他還補(bǔ)充道：“實(shí)際的測(cè)序有其本身的一系列挑戰(zhàn)，但由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，這也對(duì)解決問(wèn)題有一定程度的助益。”

   FISSEQ需要標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡設(shè)備和在顯微鏡載物臺(tái)上控制流過(guò)樣品的復(fù)雜系統(tǒng)。流體控制系統(tǒng)在商業(yè)上是可以買到的，但對(duì)于不是專門研究顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，它們的價(jià)格可能太高了。FISSEQ產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)集也需要復(fù)雜的生物信息學(xué)工具來(lái)分析。為了解決這些需求，維斯研究所的團(tuán)隊(duì)成立了ReadCoor公司，該公司計(jì)劃向研究人員提供FISSEQ產(chǎn)品和服務(wù)。

 

微小的空泡

 

   許多研究人員不需要原位技術(shù)提供的空間細(xì)節(jié)，特別是在免疫學(xué)等細(xì)胞天然就自由漂浮的領(lǐng)域。對(duì)于這些科學(xué)家來(lái)說(shuō)，多家供應(yīng)商提供的系統(tǒng)使單細(xì)胞RNA測(cè)序變得非常容易。在這些公司競(jìng)爭(zhēng)的同時(shí)，他們也在不斷改進(jìn)自己的產(chǎn)品。

   例如，位于加州普萊森頓的10X Genomics公司是用戶友好型單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的先驅(qū)之一。要使用該公司的系統(tǒng)，研究人員只需將懸浮細(xì)胞的樣本加載到一個(gè)專門的微流控芯片上。微流控裝置將樣本分離成數(shù)千個(gè)微小的液滴，每個(gè)液滴包含一個(gè)細(xì)胞和一個(gè)凝膠珠。這些珠子帶有獨(dú)特的寡核苷酸條形碼。然后，這些液滴經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的逆轉(zhuǎn)錄和測(cè)序，產(chǎn)生一個(gè)數(shù)據(jù)集，在這個(gè)數(shù)據(jù)集中，每個(gè)細(xì)胞的完整轉(zhuǎn)錄組都與其各自的條形碼相連。該系統(tǒng)附帶的軟件可以讓研究人員瀏覽和可視化數(shù)據(jù)，或者他們也可以將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，用自己的算法進(jìn)行處理。

   最初的10X系統(tǒng)側(cè)重于單細(xì)胞RNA測(cè)序，但新版本增加了同步DNA測(cè)序和染色質(zhì)分析。10X公司首席科學(xué)官兼聯(lián)合創(chuàng)始人Ben Hindson說(shuō)：“我們?cè)黾恿诉@一功能來(lái)觀察蛋白質(zhì)的表達(dá)，我們可以對(duì)抗體或其他可能與細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行條形碼編碼，并在觀察基因表達(dá)的同時(shí)將其讀出，可能還包括它們特定的DNA克隆類型。” 

   在該系統(tǒng)當(dāng)前的技術(shù)水平上，在一個(gè)給定的實(shí)驗(yàn)中，研究者可以同時(shí)觀察特定細(xì)胞的兩個(gè)特征，例如，跟蹤淋巴細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)和同一細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄組。Hindson預(yù)計(jì)，未來(lái)的系統(tǒng)將允許更多的同步分析，從每個(gè)細(xì)胞中提取更多數(shù)據(jù)。他說(shuō)：“當(dāng)我們展望這一領(lǐng)域的未來(lái)時(shí)，從一次運(yùn)行中獲得盡可能更多的信息順理成章。”

   微流控系統(tǒng)的速度使研究人員能夠研究大量的單細(xì)胞。每個(gè)芯片有八個(gè)通道，每個(gè)通道可以容納1萬(wàn)個(gè)單元，每次運(yùn)行的潛在通量為8萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。的確，該公司已經(jīng)展示了在短短幾天內(nèi)分離、條形碼編碼和測(cè)序100多萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的完整轉(zhuǎn)錄本的能力。

   然而，雄心勃勃的計(jì)劃著復(fù)制這種巨大成就的研究人員們，應(yīng)該準(zhǔn)備好迎接一些來(lái)自價(jià)格方面的沖擊波。Hindson解釋說(shuō)，雖然10X系統(tǒng)本身的定價(jià)符合學(xué)術(shù)資本預(yù)算和撥款建議，但每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)RNA分子的測(cè)序成本隨著實(shí)驗(yàn)規(guī)模的擴(kuò)大而迅速上升。

   幸運(yùn)的是，一旦細(xì)胞被分離并進(jìn)行條形碼編碼，研究人員就可以決定他們的實(shí)驗(yàn)所需的測(cè)序水平。只想將細(xì)胞分類為特定類別的免疫學(xué)家，可能只需要對(duì)更多細(xì)胞較少的測(cè)序讀數(shù)；而致力于新發(fā)現(xiàn)的分子生物學(xué)家可能會(huì)需要在更少的細(xì)胞上獲取更多的測(cè)序讀數(shù)。

 

幾率的游戲

 

   其他制造商也提供單細(xì)胞測(cè)序工具，每家公司都有自己的細(xì)胞分選和條形碼編碼策略。專家建議剛剛開始進(jìn)行RNA測(cè)序的科研人員仔細(xì)比較這些選項(xiàng)，因?yàn)樗鼈冇胁煌膬?yōu)點(diǎn)和局限性。

   實(shí)驗(yàn)儀器和試劑巨頭BD Biosciences使用一種簡(jiǎn)單但穩(wěn)定的細(xì)胞條形碼編碼方法，該方法基于一種稱為泊松分布的統(tǒng)計(jì)現(xiàn)象。在該公司的Rhapsody細(xì)胞索引系統(tǒng)中，實(shí)驗(yàn)人員將每個(gè)樣本稀釋至包含約2萬(wàn)個(gè)自由漂浮細(xì)胞，然后將樣本裝載到一個(gè)包含20萬(wàn)個(gè)微孔的特殊設(shè)計(jì)的盒子中。在每孔只稀釋0.1個(gè)細(xì)胞的情況下，泊松分布意味著含有細(xì)胞的孔有可能只有一個(gè)單細(xì)胞。然后，研究人員將標(biāo)記了寡核苷酸的珠子裝載到盒子中，每個(gè)珠子都帶有一個(gè)獨(dú)特的條形碼，條形碼上有一個(gè)多聚腺苷化標(biāo)簽，可以與mRNA結(jié)合。

   新澤西州富蘭克林湖BD公司的應(yīng)用市場(chǎng)高級(jí)總監(jiān)Stephen Kulisch解釋說(shuō)，這些孔的設(shè)計(jì)使得它們實(shí)際上只能容納一個(gè)細(xì)胞和一個(gè)珠子，所以任何多余的珠子都可以通過(guò)簡(jiǎn)單的洗滌從盒子中洗掉。一個(gè)可選配的成像系統(tǒng)允許調(diào)查人員檢查這一過(guò)程的效率。Kulisch說(shuō)：“你可以對(duì)這個(gè)陣列進(jìn)行成像，得到關(guān)于多方位的一些非常好的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以及你捕獲了多少個(gè)細(xì)胞，你有多少個(gè)珠子與細(xì)胞的組合。”

   一旦單個(gè)細(xì)胞與條形碼珠子完成配對(duì)，該系統(tǒng)遵循與其他RNA測(cè)序方法相同的一般路徑—裂解細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄RNA，然后對(duì)得到的DNA進(jìn)行測(cè)序。因?yàn)镈NA分子綁定了與它們共用一孔的多腺苷條形碼，所以該系統(tǒng)的軟件可以將每個(gè)序列追溯到產(chǎn)生它的細(xì)胞。

   像10X一樣，BD也在努力從每個(gè)細(xì)胞中提取更多的數(shù)據(jù)。該公司現(xiàn)在提供了一系列用自己的分子條形碼標(biāo)記的抗體。通過(guò)再將裝入Rhapsody試劑盒之前的細(xì)胞，與這些抗體孵育，科研人員可以從同一細(xì)胞中獲得完整的轉(zhuǎn)錄組序列和蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)。

   雖然熒光激活的流式細(xì)胞分選儀也可以進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)記，但BD系統(tǒng)極大地?cái)U(kuò)大了人們可以在實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)記數(shù)量。Kulisch說(shuō)：“這項(xiàng)技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)相比的優(yōu)勢(shì)在于，你可以做非常多的靶點(diǎn)。”他補(bǔ)充說(shuō)，“我們已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)部同時(shí)標(biāo)記了40個(gè)蛋白質(zhì)，但合作伙伴甚至在同時(shí)做多達(dá)100個(gè)蛋白質(zhì)。”流式細(xì)胞儀受限于它們可以追蹤的熒光顏色的數(shù)量，通常每次只能追蹤幾種。

   對(duì)于沒有細(xì)胞分選儀的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，條形碼編碼的抗體也更容易使用。Kulisch估計(jì)，完整的Rhapsody系統(tǒng)可以安裝在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，并在交付后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)運(yùn)行，而沒有成像選項(xiàng)的系統(tǒng)“幾乎就像凝膠切割平臺(tái)一樣容易安裝”。與10X系統(tǒng)一樣，Rhapsody的定價(jià)也符合各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的預(yù)算，持續(xù)費(fèi)用主要由測(cè)序花銷來(lái)體現(xiàn)。

 

年輕人，要驗(yàn)證蛋白質(zhì)水平

 

   通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平來(lái)驗(yàn)證單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果正在迅速成為標(biāo)準(zhǔn)做法。他說(shuō)：“我們看到很多客戶都在使用10X儀器，或者類似的儀器和方法，現(xiàn)在他們基本上都在進(jìn)行下一步的蛋白質(zhì)驗(yàn)證，這是審稿人和出版商要求的，“加州圣何塞ProteinSimple的營(yíng)銷總監(jiān)Kelly Gardner說(shuō)。

   Gardner銷售的名為Milo的產(chǎn)品將蛋白質(zhì)追蹤發(fā)揮到了邏輯層面的極致：?jiǎn)渭?xì)胞Western分子印跡，即使是最挑剔的第三方審稿人也會(huì)滿意。該系統(tǒng)由一塊上面有一層薄聚丙烯酰胺凝膠的玻璃片組成。超過(guò)6000個(gè)微孔中點(diǎn)有這種凝膠。與BD平臺(tái)和其他平臺(tái)類似，Milo使用泊松分布和受控加載來(lái)分發(fā)細(xì)胞。加德納說(shuō)：“很多孔都是空的，而有些孔只有一個(gè)細(xì)胞。”

   細(xì)胞一旦被放入，載玻片就會(huì)進(jìn)入臺(tái)式的Milo儀器，該儀器裂解細(xì)胞，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠電泳，然后在凝膠中使用一種專有的、紫外線激活的化合物來(lái)使蛋白質(zhì)在原位發(fā)生交聯(lián)。這消除了傳統(tǒng)Western分子印記轉(zhuǎn)膜步驟中固有的蛋白質(zhì)損失，并達(dá)到了在單細(xì)胞中探測(cè)蛋白質(zhì)所必需的靈敏度。之后，這一過(guò)程就像標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)印跡一樣繼續(xù)進(jìn)行，先是第一抗體，然后是熒光標(biāo)記的第二抗體。最后，用微陣列掃描儀讀取結(jié)果。

   Gardner說(shuō)：“你最終得到了一個(gè)單細(xì)胞微陣列；我們有一個(gè)叫做Scout的軟件包，它可以拍攝所有這些圖像，檢測(cè)峰值，并量化每個(gè)單細(xì)胞的峰值面積。”目前的系統(tǒng)不能同時(shí)提供來(lái)自同一細(xì)胞的RNA序列信息，但Gardner說(shuō)，該公司正在努力做到這一點(diǎn)。

   同時(shí)，經(jīng)過(guò)處理的Milo載玻片可以儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，使研究人員能夠分離樣本，平行的進(jìn)行RNA測(cè)序和單細(xì)胞蛋白印記，然后比較結(jié)果。Milo系統(tǒng)最常見的用途是服務(wù)于那些已經(jīng)在進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)需要驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況的研究人員。

   與其他設(shè)備制造商一樣，ProteinSimple試圖讓有需要的研究人員能夠接觸到他們的產(chǎn)品。用戶友好性也是一個(gè)主要的關(guān)注點(diǎn)，Gardner說(shuō)，“我們甚至有非專業(yè)研究人員已經(jīng)開始進(jìn)行測(cè)試，在他們第一次接觸儀器時(shí)就已經(jīng)開始了。”

   無(wú)論他們使用何種方法，該領(lǐng)域的專家們一致認(rèn)為，單細(xì)胞RNA分析正在推動(dòng)一波巨大的探索浪潮。“似乎每周都有新的論文出現(xiàn)在高水平期刊上，他們有一個(gè)新穎的解決方案，提供了一個(gè)新的視角。”Hindson說(shuō)�！�

 

《科學(xué)新聞》 (科學(xué)新聞2021年2月刊 科學(xué)·生命)