在21世紀(jì)之交，冠狀病毒是病毒學(xué)中最晦澀難懂的課題之一——人們很難對(duì)只會(huì)引起輕微鼻塞的病原體產(chǎn)生太多興趣。盡管為資金苦苦掙扎，但還是有一些科學(xué)家對(duì)這些RNA病毒進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究。然后，在2002年，成群的患者突然出現(xiàn)了。一種新型的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS），與一種從動(dòng)物傳染給人類的新型冠狀病毒聯(lián)系起來。幾千例病例和數(shù)百例死亡之后，公共衛(wèi)生官員控制住了SARS的傳播，但冠狀病毒學(xué)領(lǐng)域卻被徹底改變了。

   在SARS危機(jī)之后，野生動(dòng)物調(diào)查和監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，自然界中有許多冠狀病毒，理論上在適當(dāng)?shù)那闆r下，可能會(huì)傳染給人類。到2019年，這些發(fā)現(xiàn)以及由人畜共患病冠狀病毒感染引起的另一種嚴(yán)重呼吸道疾病——中東呼吸綜合征（MERS）的出現(xiàn)清楚表明，冠狀病毒對(duì)全球健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。然后，2020年新冠病毒出現(xiàn)，全球新冠肺炎疫情大流行開始。隨著這場(chǎng)危機(jī)的規(guī)模變得清晰，全球科學(xué)家和制藥公司開始聯(lián)合起來應(yīng)對(duì)它，通常會(huì)重新利用為對(duì)抗其他疾病而開發(fā)的技術(shù)。2020年是每個(gè)人都成為冠狀病毒學(xué)家的一年。

打通LAMP技術(shù)

   對(duì)于疫苗開發(fā)人員來說，前方的道路既明顯又艱難。甚至在世界衛(wèi)生組織宣布新冠肺炎疫情全球大流行之前，數(shù)百名學(xué)術(shù)和企業(yè)科學(xué)家就已經(jīng)將現(xiàn)有的工具和技術(shù)用于開發(fā)新冠病毒疫苗。然而，隨著這項(xiàng)努力的推進(jìn)，公共衛(wèi)生官員迫切需要可用的診斷測(cè)試方法。由于許多新冠病毒感染是無癥狀或輕型的，跟蹤病毒的傳播需要快速、可靠的檢測(cè)，而現(xiàn)有的資源無法勝任這一任務(wù)。幸運(yùn)的是，援軍已經(jīng)在路上。

   “在危機(jī)之前，我們從來沒有研究過冠狀病毒。”法國(guó)蒙彼利埃國(guó)家科學(xué)研究中心Sys2Diag項(xiàng)目主任Franck Molina坦言。然而，Molina的團(tuán)隊(duì)處于開發(fā)新一代新冠病毒測(cè)試方法的理想位置——實(shí)驗(yàn)室的學(xué)術(shù)—企業(yè)協(xié)作使團(tuán)隊(duì)具有多學(xué)科優(yōu)勢(shì)，包括從實(shí)驗(yàn)室研究人員到人工智能和生物信息學(xué)工程師的一切。Sys2Diag此前開發(fā)了用于定制癌癥治療的液體活檢測(cè)試，現(xiàn)在轉(zhuǎn)向測(cè)量病毒RNA，而非腫瘤生物標(biāo)記物。

   當(dāng)該團(tuán)隊(duì)的研究人員開始開發(fā)新的新冠病毒診斷系統(tǒng)時(shí)，有的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始使用PCR檢測(cè)。這種測(cè)試的主要缺點(diǎn)是需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室、訓(xùn)練有素的人員和昂貴的熱循環(huán)器，而所有這些都供不應(yīng)求。Molina和同事專注于利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）創(chuàng)造一種更簡(jiǎn)單、更便宜的測(cè)試方法。“LAMP的機(jī)器只是一臺(tái)加熱器，而且我們知道這項(xiàng)技術(shù)的特性。”Molina說。

   除了使用更簡(jiǎn)單的設(shè)備進(jìn)行DNA擴(kuò)增外，研究人員還盡可能簡(jiǎn)化從樣本收集到結(jié)果報(bào)告的所有工作。2020年6月，該系統(tǒng)的最后一次迭代在美國(guó)和歐盟獲得了市場(chǎng)批準(zhǔn)，患者向試管中吐唾液后40分鐘就能產(chǎn)生可靠的結(jié)果。在這個(gè)過程的最后，智能手機(jī)應(yīng)用程序?qū)⒆x取試劑盒結(jié)果。“然后，你馬上就有了格式化的測(cè)試結(jié)果，陽性或陰性，信息會(huì)自動(dòng)發(fā)送到數(shù)據(jù)庫。”Molina表示。即使是受過最低程度訓(xùn)練的技術(shù)人員也幾乎可以在任何地方開展測(cè)試。

   從Sys2Diag分離出來的SkillCell公司現(xiàn)在以EasyCOV的名稱出售這種測(cè)試系統(tǒng)。Molina說，它可以在世界各地的機(jī)場(chǎng)、醫(yī)院、診所和各種需要對(duì)員工進(jìn)行檢測(cè)的行業(yè)中使用。它與其他快速檢測(cè)病毒產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)，例如雅培的ID NOW COVID-19系統(tǒng)，該系統(tǒng)也使用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

免疫計(jì)數(shù)

   雖然許多生物學(xué)家和生命科學(xué)公司改變了工作重點(diǎn)，以幫助對(duì)抗這種新病毒，但另一些人則只是在大流行病來臨之際繼續(xù)常規(guī)工作。世界上最大的實(shí)驗(yàn)室及診斷試劑和設(shè)備供應(yīng)商之一珀金埃爾默（PerkinElmer）便是如此。“我們的目錄上有幾千種產(chǎn)品，當(dāng)大流行病發(fā)生時(shí)，我們立即注意到了這一點(diǎn)。”珀金埃爾默子公司——歐蒙醫(yī)學(xué)（EUROIMMUN US）科學(xué)事務(wù)經(jīng)理Iswariya Venkataraman表示。

   2019年12月，當(dāng)新冠病毒暴發(fā)的范圍變得清晰時(shí)，歐蒙醫(yī)學(xué)開始開發(fā)檢測(cè)病毒的PCR測(cè)試，以及針對(duì)病毒抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。Venkataraman指出：“我們的首要任務(wù)是能診斷感染，然后了解感染后的體液免疫反應(yīng)。”盡管在疫情大流行早期，識(shí)別并隔離感染者的迫切需要占據(jù)了大部分注意力，但公共衛(wèi)生官員很快意識(shí)到抗體篩查的重要性。

   2020年5月初，歐蒙醫(yī)學(xué)獲準(zhǔn)進(jìn)行快速定性檢測(cè)，以檢測(cè)針對(duì)新冠病毒刺突糖蛋白的抗體。該測(cè)試使用純化的刺突S1結(jié)構(gòu)域（通常被認(rèn)為是病毒上最特異性的抗原靶點(diǎn)），將任何醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都熟悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序與免疫球蛋白G（IgG）抗體結(jié)合。IgG在感染晚期出現(xiàn)，被認(rèn)為是基于抗體的體液免疫的良好長(zhǎng)期標(biāo)記物。Venkataraman表示：“對(duì)于IgG抗體來說，中位發(fā)病時(shí)間大約是（感染后的）第14或15天。”

   隨著疫情大流行的持續(xù)，定性檢測(cè)顯示，個(gè)人對(duì)病毒的免疫反應(yīng)存在很大差異，一些人在感染數(shù)周內(nèi)檢測(cè)出抗體呈陰性，而另一些人感染數(shù)月后仍呈陽性。與此同時(shí)，疫苗開發(fā)人員正在加緊進(jìn)行臨床試驗(yàn)，他們不僅需要知道產(chǎn)品能否引發(fā)抗體反應(yīng)，而且需要知道這些反應(yīng)有多強(qiáng)烈。歐蒙醫(yī)學(xué)通過校準(zhǔn)他們建立的定性測(cè)試來滿足這一需求。“這是完全相同的抗原靶點(diǎn)，只是增加了校準(zhǔn)器來定量。”Venkataraman說。該公司于2020年12月發(fā)布了名為QuantiVac的新測(cè)試試劑盒。

   目前，QuantiVac在歐洲作為定量測(cè)試、在美國(guó)作為半定量測(cè)試試劑盒銷售。區(qū)別是由于美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）要求定量檢測(cè)基于既定的國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)，而目前尚不存在針對(duì)新冠病毒抗體的參考標(biāo)準(zhǔn)。“當(dāng)有可用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，我們將校準(zhǔn)化驗(yàn)結(jié)果。”Venkataraman說。

   QuantiVac試劑盒包括一套6個(gè)參考樣本，代表一系列抗體濃度。Venkataraman指出，“有了這些數(shù)據(jù)，你就可以繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。一旦有了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以確定樣本中未知的濃度。”他補(bǔ)充道，疫苗開發(fā)人員和免疫學(xué)家應(yīng)該會(huì)發(fā)現(xiàn)，定量數(shù)據(jù)對(duì)詳細(xì)描述患者免疫反應(yīng)很有用。

抗體可以看出差異

   其他專注于診斷測(cè)試的公司也走了類似的道路，有著類似的時(shí)間表。“2020年2月，我們討論了抗體檢測(cè)在疫情大流行管理中可能發(fā)揮的作用。”位于德國(guó)潘茨堡的羅氏診斷公司免疫檢測(cè)開發(fā)和系統(tǒng)集成主管Beatus Ofenloch-Haehnle表示。2020年3月的第二周，他和同事正在改進(jìn)現(xiàn)有的羅氏檢測(cè)方法，以檢測(cè)新冠病毒抗體，由此產(chǎn)生的病毒接觸的定性分析6周后在歐洲和美國(guó)推出。

   與歐蒙醫(yī)學(xué)的檢測(cè)不同，羅氏定性檢測(cè)識(shí)別的是針對(duì)新冠病毒核衣殼蛋白的抗體反應(yīng)，而不是刺突糖蛋白。該測(cè)試使用的不是標(biāo)準(zhǔn)的ELISA，而是羅氏專利Elecsys電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。在這種技術(shù)中，兩種不同的抗原制劑分別與不同的偶聯(lián)物結(jié)合，與樣本中的抗體結(jié)合，并將其連接到磁珠和發(fā)光標(biāo)記物上。然后，磁鐵沉淀抗體結(jié)合珠，外加電壓使沉淀的抗體三明治發(fā)光。

   整個(gè)測(cè)試在羅氏完善的cobas自動(dòng)化平臺(tái)上運(yùn)行。“我們有20年的經(jīng)驗(yàn)來開發(fā)各種免疫分析方法。”Ofenloch-Haehnle指出。由于Elecsys的硬件已經(jīng)被用于世界各地超過4萬個(gè)診斷和研究實(shí)驗(yàn)室的其他分析，新冠病毒暴露測(cè)試對(duì)用戶來說很容易采用。

   高水平的自動(dòng)化和數(shù)十年的用戶界面改進(jìn)，意味著cobas驅(qū)動(dòng)的Elecsys檢測(cè)方法對(duì)新手來說也很容易上手。Ofenloch-Haehnle表示，許多實(shí)驗(yàn)室第一次購買cobas系統(tǒng)只是為了運(yùn)行新冠病毒測(cè)試。12微升的血液樣本，整個(gè)過程持續(xù)18分鐘。最大的cobas系統(tǒng)每小時(shí)可以完成300個(gè)測(cè)試，技術(shù)員只需要加載和卸載樣本。

   因?yàn)槟軝z測(cè)病毒核衣殼，因此羅氏定性檢測(cè)對(duì)于識(shí)別感染病毒的個(gè)體很有用。然而，目前所有處于臨床開發(fā)后期階段的疫苗都只針對(duì)外部刺突糖蛋白激發(fā)免疫反應(yīng)，而Elecsys的新冠病毒定性檢測(cè)無法檢測(cè)到這些抗體。“我們決定開發(fā)第二種檢測(cè)，這次是定量檢測(cè)，因?yàn)槟阈枰u(píng)估抗體水平并提出重新接種疫苗或免疫的潛在閾值。”Ofenloch-Haehnle表示。

   2020年9月，羅氏的第二種檢測(cè)在歐洲和美國(guó)發(fā)布，使用相同的Elecsys平臺(tái)提供抗刺突保護(hù)性免疫球蛋白G的定量測(cè)量。這兩種檢測(cè)方法在某些情況下可以一起使用。“雖然核衣殼完全來自自然感染，但有了抗刺突試驗(yàn)，人們可以在接種疫苗的個(gè)體中看到是否發(fā)生了自然感染，也可以區(qū)分人體對(duì)疫苗和自然感染的反應(yīng)。”Ofenloch-Haehnle解釋道。

“T”時(shí)間

   盡管抗體檢測(cè)對(duì)于監(jiān)測(cè)疫情大流行的范圍和跟蹤疫苗反應(yīng)至關(guān)重要，但它們只測(cè)量了對(duì)新冠病毒免疫反應(yīng)的一個(gè)方面。除了通過抗體獲得體液免疫外，感染病毒的人還會(huì)通過“殺手”T細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫。“T細(xì)胞與身體對(duì)新冠病毒的反應(yīng)密切相關(guān)。”位于英國(guó)阿賓頓的牛津免疫技術(shù)公司首席執(zhí)行官Peter Wrighton-Smith指出。

   然而，T細(xì)胞反應(yīng)更難以測(cè)量，而且研究和臨床實(shí)驗(yàn)室都難以確定細(xì)胞免疫在新冠病毒中到底有多重要。“我們?cè)趯W(xué)術(shù)文獻(xiàn)中遇到的一個(gè)問題是，研究結(jié)果都使用不同的方法。”Wrighton-Smith說。為了解決這個(gè)問題，他的公司開始為研究實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，以測(cè)試人體面對(duì)新冠病毒時(shí)的T細(xì)胞反應(yīng)。這些試劑盒于2020年5月發(fā)布，隨后成為該公司與英國(guó)公共衛(wèi)生部合作進(jìn)行的一項(xiàng)研究的核心，研究分析醫(yī)護(hù)人員和急救人員的T細(xì)胞反應(yīng)。

   “我們一開始對(duì)人們進(jìn)行了測(cè)試，然后在隨后的幾個(gè)月里跟蹤他們，看看誰感染了新冠病毒。”Wrighton-Smith說。結(jié)果顯示，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫是許多感染的共同特征。關(guān)鍵是，強(qiáng)大的T細(xì)胞反應(yīng)與對(duì)抗再感染的免疫力密切相關(guān)；沒有產(chǎn)生這種反應(yīng)的人更有可能再次感染。“在決定誰具有免疫力方面，T細(xì)胞可能比抗體更重要。”Wrighton-Smith說。

   為了測(cè)量臨床環(huán)境中的細(xì)胞免疫，牛津免疫技術(shù)公司求助于T-Spot，這是他們開發(fā)了18年的平臺(tái)。通過這個(gè)系統(tǒng)，技術(shù)人員從血液樣本中分離出T細(xì)胞，計(jì)數(shù)并將它們分布到多孔板中，然后進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)量對(duì)測(cè)試抗原產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量。該公司的第一款產(chǎn)品T-SPOT.TB已經(jīng)在世界范圍內(nèi)用于追蹤細(xì)胞對(duì)結(jié)核病的反應(yīng)。“通過識(shí)別你是否有這些細(xì)胞，能夠確認(rèn)你是否感染了或者最近是否接觸過新冠病毒。通過計(jì)算反應(yīng)的強(qiáng)烈程度，還可以告訴你免疫的程度。”Wrighton-Smith說。

   T-SPOT Discovery則既可以用作定性檢測(cè)，也可以用作定量檢測(cè)。“我們正在為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)而努力，（因?yàn)椋┪覀冇幸环N技術(shù)，我們認(rèn)為它在疫情的下一階段會(huì)非常重要。”Wrighton-Smith表示。他強(qiáng)調(diào)，和其他研究新冠病毒的相關(guān)技術(shù)的人一樣，雖然有效疫苗的出現(xiàn)有望控制病毒，但對(duì)創(chuàng)新的需求——無論是針對(duì)這次疫情還是未來的大流行病，仍將持續(xù)存在�！�

Alan Dove是馬薩諸塞州的科學(xué)作者和編輯。

鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2021年1月22日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見https://www.science.org/content/article/pandemic-pivot-how-scientists-answered-call-diagnostic-tests。