自從17世紀(jì)自學(xué)成才的安東尼•范•列文虎克透過手工制作的鏡片發(fā)現(xiàn)了一群“微小動物”以來，科學(xué)家們一直在努力進(jìn)行更近距離的觀察。隨著分子生物學(xué)的出現(xiàn)，生物學(xué)家對細(xì)胞的研究主要集中在逐漸變小的結(jié)構(gòu)的多樣性上，近年來也專注于研究逐漸縮小的樣本。
縮小樣本量對于理解多細(xì)胞生物學(xué)的一個核心悖論是很重要的：每個細(xì)胞都是一個個體，但必須與周圍的細(xì)胞協(xié)調(diào)活動。因此，生物學(xué)家真正想要的是一種可以單獨研究每個細(xì)胞中單個分子的方法，然后將結(jié)果關(guān)聯(lián)起來。
這是一項艱巨的任務(wù)，但是生物化學(xué)、微流體學(xué)、生物信息學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)的最新進(jìn)展已經(jīng)在填補這一空白方面取得了長足的進(jìn)步。如今，研究人員可以對基因組DNA或信使RNA進(jìn)行測序、對蛋白質(zhì)進(jìn)行編目，或者對單個細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并在實驗中數(shù)百次甚至數(shù)千次地重復(fù)這一過程，生成非常詳細(xì)的個體和集體細(xì)胞活動圖像。隨著這些單細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，科學(xué)家們正在采取下一個合乎邏輯的步驟，即結(jié)合分析，一次性研究每個細(xì)胞中兩個或更多參數(shù)。
分離不等于均等
最初，研究人員試圖從單獨的細(xì)胞中合成單細(xì)胞數(shù)據(jù)。例如，通過對一個樣本進(jìn)行單細(xì)胞信使RNA測序，并對備份樣本進(jìn)行染色質(zhì)可及性分析。他們假設(shè)每個樣本中都有完全相等的細(xì)胞，然后通過計算將這些模式聯(lián)系起來。“然而，即使這些細(xì)胞來自同一個原始樣本，試圖將細(xì)胞之間的不同模式聯(lián)系起來也存在計算上的挑戰(zhàn)。”位于加利福尼亞州普萊森頓的10X Genomics公司創(chuàng)始科學(xué)家Michael Schnall-Levin表示。
最近，細(xì)胞生物學(xué)家和技術(shù)公司開發(fā)了新一代方法，被稱為單細(xì)胞多組學(xué)、下一代多組學(xué)或多模態(tài)組學(xué)，其旨在單個樣本上進(jìn)行單細(xì)胞水平的復(fù)合分析。單細(xì)胞多組學(xué)不是通過計算合成相關(guān)性，而是以多種方式直接觀察每個細(xì)胞。“一些最早的方法可以同時檢測來自同一細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)，如CITE-seq技術(shù)和REAP-seq技術(shù)；或檢測來自同一細(xì)胞的RNA和CRISPR引導(dǎo)RNA，如Perturb-seq技術(shù)。”Schnall-Levin說。雖然最初的概念驗證實驗集中在免疫細(xì)胞上，但現(xiàn)在單細(xì)胞多組學(xué)也在癌癥研究中獲得了關(guān)注。
不管他們想要跟蹤的參數(shù)是什么，不熟悉單細(xì)胞分析的研究人員應(yīng)該花一些時間考慮樣品制備。“在測量具有不同穩(wěn)定性的分析物時，這一點尤為重要……我想說，樣品準(zhǔn)備和實驗方法是一種平衡，以確保不同分析物能同時以最好的方式被檢測到。”Schnall-Levin表示。
一旦實驗室部分完成，單細(xì)胞多組學(xué)就呈現(xiàn)出獨特的生物信息學(xué)挑戰(zhàn)。每增加一個分析物就意味著又多了一層需要處理的數(shù)據(jù)，也增加了研究人員需要處理的信息總量。不過，多組學(xué)方法也有一些補償性優(yōu)勢。“聯(lián)合測量‘—組學(xué)’消除了為推斷不同單細(xì)胞數(shù)據(jù)集之間關(guān)系而采用計算策略的需求。”Schnall-Levin解釋道。
作為單細(xì)胞測序技術(shù)的主要供應(yīng)商，10X Genomics公司已經(jīng)調(diào)整了其產(chǎn)品線以迎合迅速發(fā)展的多組學(xué)趨勢，該公司現(xiàn)在銷售用于分析幾種不同靶標(biāo)組合的設(shè)備和試劑。Schnall-Levin預(yù)計，這些產(chǎn)品將隨著該領(lǐng)域的發(fā)展而不斷增多。特別是，他預(yù)計研究人員會將更多類型的分析結(jié)合到單個實驗中。事實上，一些免疫學(xué)家已經(jīng)在單細(xì)胞水平上一次測量多達(dá)5個參數(shù)，并且這個數(shù)字似乎還在增長。
讓液滴“排排隊”
隨著研究人員在單細(xì)胞實驗中增加更多的分析維度，他們遇到了一些棘手問題。“人們研究多組學(xué)的典型途徑是在RNA上添加其他簡單分子，如蛋白質(zhì)或表觀遺傳標(biāo)記……這在全基因組和全轉(zhuǎn)錄組水平上很容易得到。”位于加利福尼亞州南舊金山的Mission Bio公司軟件和信息學(xué)副總裁Anup Parikh表示。
雖然將單個細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)蛋白質(zhì)組相關(guān)聯(lián)提供了有用的交叉檢查，但研究人員越來越想進(jìn)行包括完全正交特性的測量，如細(xì)胞的染色體拷貝數(shù)或基因組序列。由于DNA測序需要破壞細(xì)胞，因此它與需要完整細(xì)胞且同步進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組分析并不兼容。
為了解決這個問題，Mission Bio公司提供了一種微流體系統(tǒng)，其可以對單個細(xì)胞進(jìn)行一系列分析，同時跟蹤每個細(xì)胞在其中的過程。該系統(tǒng)從懸浮液中分離出單個細(xì)胞，將每個細(xì)胞分離成帶有分子條形碼的液滴。然后，這些帶條形碼的液滴會像傳送帶上的包裹一樣，通過Mission Bio公司設(shè)備上的微流體通道，“拜訪”進(jìn)行不同分析的反應(yīng)室。
“我們不會在這個過程中失去任何東西，但是可以用一些蛋白酶處理來打破細(xì)胞的反應(yīng)，與用聚合酶來擴增DNA或分析蛋白質(zhì)以及細(xì)胞外的其他任何東西的反應(yīng)分開。”Parikh說道。通過將非破壞性步驟置于破壞性步驟之前，該系統(tǒng)可以從每個細(xì)胞中獲得蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)和表觀基因組學(xué)數(shù)據(jù)。
擁有如此多的選擇，研究人員必須小心不能貪多嚼不爛。“當(dāng)處理這些類型的項目時，它很快就會變得復(fù)雜，所以你要確保有一個真正有根據(jù)的科學(xué)問題，因為其可以產(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)集。”Mission Bio公司轉(zhuǎn)化應(yīng)用和市場開發(fā)主管Aaron Llanso指出。
這種關(guān)注也影響了該公司的數(shù)據(jù)處理方法。“我們采取了一種非常有條理的方法來構(gòu)建有助于我們的科學(xué)家和制藥公司的應(yīng)用程序的信息學(xué)解決方案。這不是一種獵槍式的方法，我們有通用工具，更多的是‘我能幫助回答一個關(guān)于特定癌癥類型中癌癥克隆進(jìn)化的問題嗎’?”Parikh說。
越過彩虹
鑒于微流體可對細(xì)胞和試劑進(jìn)行精細(xì)控制，其他公司為特定類型的單細(xì)胞分析提供微流體解決方案不足為奇。對位于密蘇里州圣路易斯市的Canopy生物科學(xué)公司來說，這意味著要更新古老的免疫熒光顯微鏡技術(shù)。傳統(tǒng)上，研究人員用不同顏色的熒光染料標(biāo)記抗體，一次可視化幾種不同細(xì)胞蛋白的表達(dá)，但這種方法只適用少數(shù)幾個表位。細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)要比熒光染料標(biāo)記的顏色多得多。
Canopy公司的微流體系統(tǒng)會進(jìn)行自動化熒光標(biāo)記和圖像處理，然后重復(fù)它們。“我們以迭代的方式進(jìn)行染色，以建立真正的高復(fù)合分析，所以你可以（在微流控芯片上）用多達(dá)5種抗體的混合物進(jìn)行染色，收集這5種抗體的圖像數(shù)據(jù)，接著擦掉熒光信號，然后再次染色。”Canopy公司產(chǎn)品經(jīng)理Thomas Campbell說。系統(tǒng)將圖像數(shù)據(jù)堆疊起來，繪制出樣本中每個細(xì)胞所有蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜。雖然芯片的容量沒有任何限制，但到目前為止，通常它每次可實驗分析20至50個蛋白質(zhì)。
芯片還能保存細(xì)胞。“你可以把樣本存放在冰箱里長達(dá)兩年，然后把它拿出來并從你停下來的地方繼續(xù)，在之前分析的基礎(chǔ)上重新審視樣本。”Campbell表示。對于研究寶貴臨床樣本的研究人員來說，這可能是一個特別有用的功能。這也意味著，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，用戶能夠?qū)⑿录夹g(shù)應(yīng)用于以前的樣本。
原則上，Canopy系統(tǒng)可以用在任何傳統(tǒng)上依賴免疫熒光的領(lǐng)域。“該平臺的優(yōu)點之一是它在樣本類型方面非常靈活，我們可以做組織切片，包括新鮮的、冷凍的以及用福爾馬林固定石蠟包埋的，還可以做各種不同的細(xì)胞懸浮液。”Campbell說，目前大多數(shù)客戶都在免疫學(xué)或腫瘤學(xué)領(lǐng)域工作，但該公司還支持新冠病毒免疫分析研究和神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用。
排序困境
微流體并不是實現(xiàn)單細(xì)胞多組學(xué)的唯一途徑。事實上，對免疫學(xué)家而言，分離并分析單個細(xì)胞并不是一種新觀念。多年來，他們一直在使用流式細(xì)胞儀以多種方式分離并研究熒光標(biāo)記細(xì)胞。位于新澤西州富蘭克林湖的BD生物科學(xué)公司是流式細(xì)胞儀設(shè)備的主要制造商之一，該公司現(xiàn)在也銷售一整套為單細(xì)胞多組學(xué)量身定制的附加組件。
事實上，BD公司現(xiàn)在銷售幾乎涵蓋了單細(xì)胞多組學(xué)實驗的整個流程——從采血管、細(xì)胞分離緩沖液到流式細(xì)胞儀——的一系列設(shè)備、耗材和試劑。
“一旦（流式細(xì)胞術(shù)富集）完成，我們就會進(jìn)入BD Rhapsody系統(tǒng)，這是一個非常獨特的單細(xì)胞分割系統(tǒng)。”BD公司高級營銷總監(jiān)Ranga Partha說。Rhapsody微孔設(shè)計旨在保護(hù)脆弱的細(xì)胞，如粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和干細(xì)胞，而且該系統(tǒng)還包括一個用于視覺質(zhì)量控制的掃描設(shè)備。用于蛋白質(zhì)和RNA分析的輔助設(shè)備和試劑，無論是靶向還是跟蹤整個轉(zhuǎn)錄組，都會使系統(tǒng)更加完善。該公司還在開發(fā)一種可變的、多樣化和可連接[V（D）J]測序的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將表征單細(xì)胞中的抗體基因重排。
雖然目前Rhapsody檢測顯然是針對免疫學(xué)家的，但該領(lǐng)域與癌癥研究的重疊并未逃過該公司的注意。“我相信這項技術(shù)未來將專注于腫瘤領(lǐng)域生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。”Partha指出。
然而，即使對具有豐富流式細(xì)胞儀技術(shù)經(jīng)驗的科學(xué)家而言，單細(xì)胞多組學(xué)也面臨著獨特的挑戰(zhàn)。Partha指出，樣品制備、細(xì)胞活力檢測和生物信息學(xué)是該領(lǐng)域新人面臨的三大障礙。“讓技術(shù)嫻熟、訓(xùn)練有素的研究人員完成這三項工作是一項挑戰(zhàn)。”
為了解決這個問題，他敦促研究人員與做過類似實驗的同事交談，并與出售試劑和設(shè)備的公司聯(lián)系。“我認(rèn)為與提供檢測的公司的技術(shù)應(yīng)用專家進(jìn)行對話是一個很好的步驟……但研究人員有時會忽略它，他們繼續(xù)進(jìn)行實驗，最后數(shù)據(jù)的復(fù)雜性會變得非常高。”Partha說，與該領(lǐng)域的其他專家一樣，生物信息學(xué)是一個不斷發(fā)展的挑戰(zhàn)，隨著研究人員在單細(xì)胞實驗中增加更多實驗，這個挑戰(zhàn)可能會變得更加重要。
尋求專業(yè)幫助
盡管困難重重，但單細(xì)胞多組學(xué)的普及速度幾乎與實驗的復(fù)雜性上升速度一樣快。“這絕對是一個熱門的新興領(lǐng)域。”位于新澤西州南普萊恩菲爾德的Genewiz公司臨床開發(fā)服務(wù)主管Haythem Latif表示。不過，并不是每個對該領(lǐng)域感興趣的人都有能力進(jìn)行深入研究。幸運的是，像Genewiz這樣的研究公司很樂意幫助那些愿意把部分或全部實驗工作外包出去的研究人員。
當(dāng)選擇一家服務(wù)公司時，科學(xué)家期望花一些時間討論他們的研究、想要解決的具體問題以及公司可以提供的技術(shù)。“我們合作得很好……確保這些類型的技術(shù)參數(shù)與手頭的生物學(xué)問題相匹配。”Latif說。這些早期的談話可以避免以后的麻煩。“如果你在生物學(xué)上做的事情存在一些可行性問題，這些問題可能會被提出或者以不同的方式處理。”Latif表示。
服務(wù)提供商應(yīng)該始終為每個項目定制方法，但在許多情況下，他們會集中在老生常談的路徑上。例如，最近一種流行的策略是在單細(xì)胞水平上應(yīng)用10X Genomics公司的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)和表面蛋白標(biāo)記來獲取相應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)信息。“這是一個非常簡潔的工作流程，它是與許多客戶一起開發(fā)的……為了把這兩條信息結(jié)合起來。”Latif說。他補充道，研究人員還開始增加空間分析，以便定位細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)。
到目前為止，腫瘤學(xué)家和免疫學(xué)家是單細(xì)胞多組學(xué)最大的應(yīng)用者。Genewiz公司代表指出，其他領(lǐng)域也在研究這項技術(shù)。“干細(xì)胞分化和多能性領(lǐng)域?qū)渭?xì)胞多組學(xué)有很大興趣……有助于描述干細(xì)胞及其分化過程，其在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。”該公司首席科學(xué)家Dave Corney說。
不管他們追求的具體策略是什么，專家們一致認(rèn)為，單細(xì)胞多組學(xué)才剛剛起步，未來發(fā)展?jié)摿薮蟆?ldquo;人體有40萬億個細(xì)胞，這些細(xì)胞一直在變化。為研究人員提供工具來研究這些發(fā)現(xiàn)，將使我們更了解癌癥、阿爾茨海默病或心臟病的病因——這就是我們想要做的。”Schnall-Levin說�！�
Alan Dove 是馬薩諸塞州的科學(xué)作者和編輯。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會（www.aaas.org）發(fā)布在2021年9月24日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.science.org/content/article/combine-and-conquer-single-cell-omics-multiplies。